蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepialid chen&dai)系丛梗孢科(Moniliaceae)瓶梗青霉属Paecilomyces Bain真菌,是从冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.]中分离所得,再通过人工培养得菌丝体,作为冬虫夏草的代用品已在中成药和保健食品中广泛使用。本文主要采用冰醋酸扭体法筛选出蝙蝠蛾拟青霉优良居群及其活性部位,在此基础上研制其镇痛缓释片并进行质量评价。主要研究内容如下:1.多个居群蝙蝠蛾拟青霉菌丝体镇痛活性筛选分别对8个野生居群中分离培养的菌丝体,按两个剂量小鼠灌胃3天。采用冰醋酸扭体试验,计算镇痛百分率。结果表明,有7种菌丝体能明显降低冰醋酸所致小鼠扭体次数,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。其中采自香格里拉虎跳峡镇的XGL001居群菌丝体的中剂量(2g/kg)组镇痛百分率为42.41%,低剂量(1g/kg)组镇痛百分率为57.07%,均高于其它居群菌丝体,因此以XGL001菌丝体为最优镇痛活性菌丝体。2.蝙蝠蛾拟青霉菌丝体镇痛有效部位筛选2.1培养物和菌丝体中不同极性部位的提取分离与镇痛活性比较以XGL001菌株的培养物(固体培养所得,含菌丝体与培养基)和菌丝体(液体培养所得,不含培养基)为原料,分别用90%乙醇热回流提取和水热回流提取得到醇提物及水提物,再将醇提物分别依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。分别将上述培养物及菌丝体的醇提物、水提物、石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分及水层部分6部分进行冰醋酸扭体试验。结果表明,培养物的醇提物低剂量(6g/kg)和菌丝体的醇提物低剂量(1g/kg)、石油醚部分低剂量(1g/kg)和中剂量(2g/kg)及乙酸乙酯部分低剂量(1g/kg)均有明显的镇痛活性(P<0.05,P<0.01)。镇痛活性有菌丝体乙酸乙酯部分>菌丝体醇提物>菌丝体石油醚部分的趋势。2.2不同极性部位的核苷类成分、虫草多糖、虫草酸及总黄酮含量的测定采用苯酚硫酸法测定虫草多糖,采用紫外分光光度法测定总黄酮和虫草酸含量,采用HPLC法测定核苷类成分。建立HPLC同时测定蝙蝠蛾拟青霉培养物中尿嘧啶、尿苷、鸟苷、腺嘌呤和腺苷5种核苷类成分含量的方法。采用Waters Sun Fire C18(5μm,4.6×250mm)色谱柱;以甲醇-水为流动相,梯度洗脱,柱温30℃,检测波长260 nm,并进行方法学考察。结果表明,有镇痛活性的有效部位的核苷类成分、虫草酸和总黄酮含量均高于其他有效部位,而水提部位虫草多糖含量较高但未显示镇痛活性,推测蝙蝠蛾拟青霉中的镇痛活性成分不是虫草多糖类成分。但尚需进一步试验分离并确认镇痛活性部位或成分。3.蝙蝠蛾拟青霉培养物石油醚部分化学成分研究对有较高镇痛活性且提取物率较高的石油醚部分进行研究,利用硅胶柱色谱分离,得到2个化合物。通过理化常数及NMR光谱数据分析鉴定其化学结构,分别是麦角甾醇(ergosterol)和β-谷甾醇(β-sitosterol)。4.培养物提取物缓释片剂制备通过单因素试验与正交试验筛选菌丝体培养物醇提物的凝胶骨架缓释包衣片的处方组成。以体外释放度为指标,分别考察了HPMC的型号、用量、以及制粒与否、不同填充剂、吸收剂的用量、衣膜厚度与致孔剂的种类对药物释放的影响。结果优化处方工艺为:微粉硅胶用量为25%,HPMC(K100M)用量为25%,制粒,压片;包衣液的处方:5%EC乙醇溶液,以4%PEG-6000为致孔剂,增塑剂邻苯二甲酸二乙酯为EC量的20%。包衣增重1%,即得凝胶骨架包衣缓释片。其体外释药行为符合higuchi方程,12h释药94.11%。所筛选出的缓释包衣片工艺稳定,具有良好的12h缓释性,制备工艺的重现性和稳定性良好。5.缓释片的质量考察本品为中药提取物缓释片剂,参照《中国药典》2010版二部附录对片剂项下的有关要求,对其外观性状、片重差异、含量测定、体外释放度等各规定项目进行了考察。可知同批缓释片的片重差异均在92.5%~107.5%范围内,符合药典要求;缓释片中尿苷的平均含量为4.85μg,RSD值为2.37%;缓释片在水中可持续释药12h,且12h的累计释放度可达96.99%。该标准能较好的控制该缓释片的质量。
