水稻是最重要的粮食作物之一,在禾本科作物分化前发生过一次全基因组倍增。基因组倍增可产生大量的基因家族,是生物进化的重要驱动力,倍增或复制事件在拟南芥、水稻等植物若干miRNAs家族的分化和进化过程中扮演了重要角色。miRNAs是长约21-24 nt的小RNA分子,通过介导目标基因的降解或翻译抑制产生转录后水平上的基因沉默。目前我们对水稻基因组倍增过程中miRNAs对靶基因的调控机制的了解还不清楚,本研究以同一双胚苗来源的单倍体(1N)、二倍体(2N)和三倍体(3N)同源倍性水稻系列为材料,采用Solexa高通量测序、RT-PCR、5’-RACE、实时定量RT-PCR、转基因等方法,挖掘倍性水稻中新的miRNAs,研究不同倍性水平下miRNAs表达的时空性,分析miRNAs介导miRISC对靶基因的剪切方式,旨在初步探索不同倍性水稻miRNAs的功能,为揭示水稻多倍化过程中miRNAs分子进化及表观遗传调控机理提供科学依据。获得结果如下：1.构建单倍体、二倍体及三倍体小RNA库,并进行Solexa深度测序,获得了倍性水稻系列的小RNA信息。在1N、2N、3N水稻中分别得到≥18 nt的小RNA unique序列2800402,2196941,2298182条,能与水稻基因组匹配上的unique序列分别有1503535,1138597,1210526条,分别占总unique序列的53.69%,51.83%,52.67%。大部分序列长度在21-24 nt范围内,符合水稻小RNA序列长度特征。同时,通过与miRBase数据库进行比对,发现miR819j, miR1441, miR1857-5p, miR444d.3, miR1884b, miR819c这些测序丰度较高的miRNAs可能是倍性水稻系列在孕穗期特异表达的。miR156、miR166、miR167、miR168、miR172家族的成员表现出很高的丰度,说明其对于倍性水稻基本的代谢调控是必需的。2.从小RNA序列中预测和验证了34个新的miRNAs。根据miRNA前体的二级结构特征,用生物信息分析软件对Solexa数据进行分析,最后预测了34个新的miRNAs。RNA加尾和引物延伸RT-PCR的验证结果表明候选的miRNAs均能在倍性水稻中检测到表达。这些miRNAs分布于水稻12条染色体,来源于基因内含子、重复序列、逆转录转座子等区域,表明MIRNA基因家族分布的多态性,也暗示miRNAs进化途径的多样性。同时,本研究对候选miRNAs进行了靶基因的预测,靶基因的功能涉及水稻生长发育、抗逆抗病、信号转导等各个生物学过程。3. miRNAs的表达会随着水稻倍性的变化发生改变,且与剂量效应无严格的相关性。为了探讨倍性水稻中miRNAs表达的时空性,本研究以U6 snRNA作为内参,采用SYBR Green荧光定量RT-PCR对单倍体、二倍体、三倍体不同发育时期及不同器官的部分miRNAs的表达进行了相对定量。结果表明,在幼苗期及分蘖期单倍体miR#3、miR#17、miR#23、miR#25的表达均低于二倍体,到了孕穗期及成熟期,这4个miRNAs的表达均高于二倍体,推测这些miRNAs的表达与单倍体的生殖生长相关。而三倍体中这4个miRNAs在幼苗期及分蘖期的表达也低于二倍体,孕穗期及成熟期表达与二倍体差异不大。再根据其他miRNAs的表达情况,发现miRNAs在不同时期表达会随着倍性的变化发生改变。而miRNAs在倍性水稻根、茎、叶、穗中的表达似乎无规律性,表明miRNAs表达调控的复杂性。相对于二倍体,一些miRNAs在单倍体、三倍体中的表达表现出高表达或低表达,这可能是miRNAs表达的组织特异性,或是倍性水稻miRNAs表达的特点之一。倍性水稻miRNAs表达的时空性有一个共同特点,即miRNAs的表达并不会随着基因组的加倍而加倍表达,表明miRNAs的表达与基因剂量效应无严格的相关性。4.水稻多倍化可能对miRNAs介导的靶基因剪切位点产生影响。miRNAs主要是通过对靶基因进行调控行使其生物学功能的。本研究运用5’-RACE技术初步验证了5个miRNAs调控的6个靶基因。通过对miRNAs介导靶基因的切割位点分析,发现这些位点表现出多态性,多分布在miRNAs与靶基因结合位点的上下游,而且不同倍性水稻中的位点也有所不同。比较典型的是：miR827a介导的靶基因LOC_Os04g48390的切割位点,与单倍体、二倍体不同,三倍体中miRNAs与靶基因的结合位点外检测到了切割位点,其他miRNAs的作用方式也存在这种情况。这表明随着水稻多倍化发生,miRNAs介导的靶基因切割位点可能发生了变化,即调控模式发生了改变。5. miRNAs对靶基因的调控模式具有多样性。选择2个已经过5’-RACE验证的靶基因和对应的miRNAs进行实时定量PCR。结果表明niRNAs与相应的靶基因表达存在两种情况：(1)miRNAs上调表达时,相应靶基因就下调表达；(2)miRNAs的表达与靶基因的表达没有严格的负相关性。这正好说明了miRNAs对靶基因调控的复杂性,即存在一对一(一个miRNA调控一个靶基因)、一对多(一个miRNA调控多个靶基因)和多对一(多个miRNAs调控一个靶基因)调控模式。6.构建miRNAs过表达载体,并转化日本晴水稻。为了研究miRNAs的功能,本研究构建了2个候选miRNAs的过表达载体pHB-miR#9, pHB-miR#14并进行了转化日本晴的初步工作,获得了pHB-miR#14的阳性植株,为进一步探讨miRNAs的功能奠定了基础。7. miRNAs可能与DNA甲基化协同调控基因的表达。我们利用甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)对单倍体与二倍体水稻蜀恢527、蜀恢363及其杂交后代的5’-CpCpGpG位点的胞嘧啶甲基化进行了分析,发现甲基化存在差异的基因可能也是miRNA的靶基因。本研究揭示了甲基化差异片段对应的基因与miRNA之间的关系。从单倍体水稻与水稻蜀恢527、蜀恢363的杂交后代中分离的甲基化差异片段对应的基因LOC_Os05g22920、LOC_Os01g46750、LOC_Os12g39120、(LOC_Os05g26926, LOC_Os05g26902, LOC_Os05g26914)分别受到了miR399e、miR2925、miR156a-k、miR172b的调控。同时,从双胚苗水稻单倍体与其对应二倍体杂交后代分离的甲基化片段相应的基因也受到了miRNAs的调控,其中H2A/H2B/H3/H4核心组蛋白编码基因LOC_Os10g28230受到miR3979的调控。因此,推测miRNAs与DNA甲基化具有一定的相关性。
