植物病原卵菌RXLR效应蛋白Avr1b互作蛋白的初步筛选

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卵菌(Oomycetes)包括疫霉菌、霜霉菌、腐霉菌等,大多都是重要的植物病原菌,在世界范围内,给许多农作物和花卉植物带来毁灭性危害。大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)是卵菌遗传学和病理学研究的重要模式种,引致重要农作物大豆的疫霉根腐病。研究植物与病原卵菌互作的分子机制,从分子水平上揭示植物的抗病机理,对卵菌类病害的有效防治具有重要的意义。在植物-病原互作过程中,病原菌的效应基因编码产物被植物识别时被称为无毒基因。病原卵菌编码一大类被称为RXLR的效应蛋白,在其信号肽序列下游含有保守的RxLR-dEER结构域。RXLR效应蛋白在卵菌致病过程中起关键的作用。大豆疫霉菌( P. sojae )的Avr1b基因在大豆疫霉菌与大豆互作中,除了被抗病基因Rpslb识别而激活植物抗病反应外,在不被识别的情况下还具有重要的毒性功能。本研究以实验室成功构建的寄生疫霉菌(P. parasitica)休止孢萌发阶段以及侵染拟南芥阶段的病组织cDNA文库为材料,利用酵母双杂交方法筛选鉴定与Avr1b互作的蛋白。采用PCR扩增获得Avr1b目的基因,克隆到酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-mAvr1b。通过cDNA文库(约2×10~7 cDNA克隆)筛选并经共转化反复验证确定了12个与Avr1b互作的候选蛋白。为了进一步研究Avr1b效应蛋白可能的植物靶标,经拟南芥同源序列比对,确定了同源程度较高的6个拟南芥基因序列。对其中4个候选植物靶标基因的进一步分析,获得与Avr1b效应蛋白互作的2个植物靶标蛋白。本项研究为进一步研究Avr1b效应蛋白的转运和在寄主植物细胞中的作用机理奠定了基础。
摘要第6-7页
ABSTRACT第7页
第一章 文献综述第10-19页
    1.1 卵菌的危害第10-11页
        1.1.1 植物病原卵菌与植物互作的研究第10-11页
        1.1.2 大豆疫霉菌的研究现状第11页
    1.2 病菌效应蛋白毒性靶标的研究进展第11-13页
        1.2.1 基因对基因假说第11-12页
        1.2.2 卵菌RXLR 效应蛋白研究概况第12页
        1.2.3 无毒基因Avr1b第12-13页
        1.2.4 效应蛋白毒性靶标第13页
    1.3 模式植物拟南芥研究概况第13-14页
    1.4 酵母双杂交研究进展第14-17页
        1.4.1 酵母双杂交系统的原理第14-15页
        1.4.2 酵母双杂交系统的优点及其局限性第15-17页
        1.4.3 酵母双杂交系统的用途及意义第17页
    1.5 本研究的理论基础第17-18页
    1.6 本研究的目的和意义第18-19页
第二章 诱饵载体PGBKT7-Avr1b 的构建及鉴定第19-24页
    2.1 材料第19页
        2.1.1 菌株及载体第19页
        2.1.2 寄生疫霉菌休止孢萌发阶段以及侵染拟南芥阶段的病组织cDNA 文库第19页
        2.1.3 主要试剂及仪器第19页
    2.2 方法第19-23页
        2.2.1 实验所用引物第19-20页
        2.2.2 PCR 扩增目的片段mAvr1b第20-21页
        2.2.3 目的片段胶回收第21页
        2.2.4 目的片段及诱饵载体pGBKT7 酶切第21-22页
        2.2.5 转化大肠杆菌及酶切检测第22页
        2.2.6 重组质粒测序鉴定第22-23页
    2.3 结果与分析第23页
        2.3.1 诱饵载体构建结果第23页
        2.3.2 诱饵载体测序结果第23页
    2.4 讨论第23-24页
第三章 效应蛋白Avr1b 的植物靶标的初步筛选第24-37页
    3.1 材料第24页
    3.2 方法第24-29页
        3.2.1 酵母感受态细胞的制备第24-25页
        3.2.2 诱饵蛋白的自激活检测第25-26页
        3.2.3 诱饵蛋白的毒性检测第26页
        3.2.4 cDNA 文库的筛选第26-27页
        3.2.5 酵母质粒提取第27页
        3.2.6 共转化验证第27-28页
        3.2.7 RT-PCR 扩增靶标基因第28-29页
        3.2.8 靶标载体的构建第29页
        3.2.9 共转化验证蛋白间相互作用第29页
    3.3 结果与分析第29-34页
        3.3.1 诱饵质粒自激活检测第29-30页
        3.3.2 诱饵蛋白毒性检测结果第30-31页
        3.3.3 Mating 方法筛选cDNA 文库结果第31页
        3.3.4 共转化方法回转验证第31-32页
        3.3.5 反复验证得到阳性候选靶标的序列分析结果第32-33页
        3.3.6 PCR 扩增靶标基因的结果第33页
        3.3.7 靶标载体的构建第33页
        3.3.8 诱饵蛋白与拟南芥植物靶标互作的共转化结果与分析第33-34页
    3.4 讨论第34-37页
第四章 结论与创新点第37-38页
    4.1 结论第37页
    4.2 创新点第37-38页
参考文献第38-43页
附录第43-49页
    一、培养基配方第43-46页
    二、载体图谱第46-49页
致谢第49-50页
作者简介第50页
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