AMD3100体内阻断SDF-1/CXCR4信号通路调节关节软骨退变的研究

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目的:动态观察Hartley豚鼠关节软骨退变的形态学改变,并监测其血液和软骨相关生化指标,探讨Hartley豚鼠原发性骨性关节炎中SDF-1/CXCR4信号通路作用机制,在此基础上,探讨AMD3100体内阻断SDF-1/CXCR4信号通路后延缓关节软骨退变的可能性,明确AMD3100的作用机制。方法:1.选用Hartley豚鼠40只,为雌性组及雄性组二大组,每组20只,其中每组分别为3月龄,6月龄,9月龄,12月龄四小组,每小组各5只。取胫骨平台软骨行组织学检测(HE和番红-0染色)并进行Mankin组织学评分:ELISA法测定其血清中SDF-1和雌二醇水平;逆转录PCR检测软骨组织内MMP-3、9、13、CXCR4、聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达水平;Western Blot检测Ⅱ型胶原蛋白表达水平。结果数据SPSS17.0软件进行处理与统计学分析。2.取6月龄雄性Hartley豚鼠36只,随机分成3组,为实验组A组,实验对照组B组,空白对照组C组,每组12只。A组中每只皮下植入Alzet微量泵,内含PBS液稀释过的AMD3100,以AMD3100浓度180ug/ml.d泵入,B组中每只皮下植入Alzet微量泵,内含PBS液,C组中不做任何处理。于2,4,8,10,12周经心脏采血离心后取上清液血清行ELISA检测SDF-1浓度;常规饲养12周后处死豚鼠,收集膝关节胫骨平台行软骨行形态学检测(HE染色和番红染色),并进行Mankin组织学评分;并行IL-1,TNF-a免疫组化;实时荧光定量PCR检测软骨组织内MMP-3,9,13,聚集蛋白聚糖,Ⅱ型胶原蛋白mRNA的表达;WesternBlot检测Ⅱ型胶原蛋白的水平。结果数据SPSS17.0软件进行处理与统计学分析。结果:1.1-1组织形态学检测(HE染色和番红染色):随月龄增加Hartley豚鼠软骨组.织退变逐渐加重,Mankin组织学评分逐渐增高,差异有统计学意义(P<0.05);在同月龄组Hartley豚鼠雌性比雄性Mankin组织学评分差异无统计学意义(P>0.05)。1-2ELISA测定:不同月龄组雌性Hartley豚鼠血清中SDF-1、雌二醇含量有统计学意义(P<0.05);不同月龄组雄性Hartley豚鼠血清中SDF-1含量有统计学意义(P<0.05);不同月龄组雄性Hartley豚鼠血清中雌二醇含量无统计学意义(P>0.05)。1-3逆转录PCR示:软骨组织中CXCR4,MMP-3,9,13灰表达量随月龄的增加逐渐增加,各月龄组间两两比较有统计学差异(P<0.05);软骨组织聚集蛋白聚糖,Ⅱ型胶原蛋白灰度值随月龄增加逐渐下降,各月龄组间两两比较有统计学差异(P<0.05);1-4Western Blot检测Ⅱ型胶原蛋白,随月龄增加,Ⅱ型胶原蛋白的水平逐渐下降,各月龄组间两两比较有统计学差异(P<0.05);1-5雌性Hartley豚鼠不同月龄雌二醇水平的变化与血清中SDF-1浓度的变化存在正相关,及与之相对应的软骨组织中CXCR4表达量呈正相关。2.2-1软骨组织形态学分析(HE染色和番红染色),结果显示:实验组较实验对照组和空白对照组Mankin评分要低,差异有统计学意义(P<0.05),软骨退变程度轻。2-2免疫组化示:实验组IL-1,TNF-a表达呈弱阳性,而实验对照组和空白对照组IL-1,TNF-a表达呈阳性或强阳性。2-3ELISA检测:实验组SDF-1含量明显低于实验对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);2-4实时荧光定量PCR检测:实验组较实验对照组和空白对照组MMP-3,9,13mRNA的表达量低,差异有统计学意义(P<0.05);实验组较实验对照组和空白对照组Ⅱ型胶原蛋白,聚集蛋白聚糖mRNA的表达量高,差异有统计学意义(P<0.05)。2-5Western Blot检测:实验组较实验对照组和空白对照组11型胶原蛋白的水平高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1. Hartley豚鼠随月龄增加膝关节软骨有骨性关节炎的表现,于3月龄的豚鼠膝关节软骨形态学正常;6月龄的豚鼠膝关节开始发生关节软骨退变;9月龄的豚鼠可形成典型的原发性骨性关节炎的病理改变;12月龄的豚鼠膝关节软骨退变比较严重。2. SDF-1/CXCR4信号通路在Hartley豚鼠骨性关节炎的发生中起着关键作用,并随月龄的增加其可诱导关节软骨退变加重。3.雌性Hartley豚鼠体内雌二醇水平的变化与SDF-1/CXCR4信号通路有相关性,呈正相关。4.AMD3100可体内阻断SDF-1/CXCR4信号通路可延缓关节软骨组织退变。5.AMD3100可体内阻断SDF-1/CXCR4信号通路,使软骨组织MMP-3,9,13mRNA的表达水平及分泌量降低;并减少Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的降解。
目录第4-5页
缩略语表第5-6页
中文摘要第6-9页
Abstract第9-11页
前言第12-15页
第一部分 SDF-1/CXCR4信号通路在Hartley豚鼠原发性骨性关节炎发病中的作用研究第15-46页
    引言第15-16页
    材料与试剂第16-17页
    方法第17-18页
    血清ELISA检测血清中SDF-1及雌二醇的含量第18-19页
    逆转录PCR步骤第19-21页
    Westren Blot 检测第21-24页
    组织形态学检测(HE染色和番红染色)观察软骨组织形态学第24-27页
    统计学分析第27页
    结果第27-40页
    讨论第40-44页
    结论第44-46页
第二部分 AMD3100体内阻断SDF-1/CXCR4信号通路对关节软骨组织形态学变化的影响第46-57页
    引言第46-47页
    材料与试剂第47页
    方法第47-48页
    结果第48-54页
    讨论第54-56页
    结论第56-57页
第三部分 AMD3100体内阻断SDF-1/CXCR4信号通路对关节软骨组织分泌MMPs及合成Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的影响第57-71页
    引言第57-58页
    材料与试剂第58页
    方法第58-60页
    统计学分析第60页
    结果第60-67页
    讨论第67-70页
    结论第70-71页
参考文献第71-78页
全文总结第78-79页
附录第79-80页
综述第80-88页
    参考文献第85-88页
攻读学位期间发表文章情况第88-89页
致谢第89页
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