猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)亦称“猪蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种重要传染病,主要危害母猪和仔猪,几乎所有养猪国家都有本病流行,该病已成为影响世界养猪业发展的重大传染病之一。世界动物卫生组织(OIE)将其列入需申报的OIE疾病名录(OIE-listed diseases)。猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性传染病,OIE将其列入OIE疾病名录。人5型复制缺陷型腺病毒载体,近年来在活载体疫苗的研制上得到了广泛应用。由于缺失了病毒非必需基因区(E1/E3),使其能够携带大片段的外源基因,而且只能在特定的细胞系中增殖,安全性得到保证。此外,该载体系统还引入了CMV启动子,使得外源基因可以高水平表达,从而确保了有效的免疫效力。口蹄疫病毒(FMDV)2A基因编码一种自剪切蛋白。目前2A已经广泛应用于基因治疗,同时也为构建二价疫苗提供了新途径。本研究旨在以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,构建一株同时表达PRRSV变异株GP5蛋白和CSFV E2蛋白的重组腺病毒疫苗。首先利用重叠PCR将GP5和E2基因通过FMDV 2A序列连接,形成一个完整的ORF,并将其克隆到腺病毒穿梭载体中,通过细菌内同源重组构建共表达PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白的重组腺病毒(rAdV-GP52AE2)。间接免疫荧光试验和Western blot证实2个外源基因均获得表达。在小鼠上进行的免疫效力评价结果显示,rAdV-GP52AE2免疫组针对CSFV的中和抗体滴度可达1:128,针对PRRSV的中和抗体滴度为1:16;在淋巴细胞增殖试验中,免疫组与阴性对照组在增殖指数上有显著差异,表明该重组腺病毒可以同时诱导抗PRRSV和CSFV的特异性体液免疫和细胞免疫。为了进一步证实其免疫效力,我们又开展了家兔免疫攻毒试验,结果显示,免疫重组腺病毒rAdV-GP52AE2的家兔产生了猪瘟特异性抗体,并且有效的抵抗了弱毒C-株的攻击,没有出现定型热反应。结果显示,利用具有自动剪切功能的FMDV 2A多肽构建的重组腺病毒有望开发成一种同时预防PRRS和CSF的新型载体疫苗。
