MicroRNA-612通过靶向调控ME1抑制膀胱癌细胞的生物学行为

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目的膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,具有高复发率和进展性的临床特征,目前对于膀胱癌的治疗以手术为主,术后化疗是一种有效预防肿瘤复发、转移的辅助治疗策略,但肿瘤对化疗药物耐药是其治疗失败的主要原因。基于此,在分子水平探讨膀胱癌的可能发病机制,有助于为膀胱癌的治疗提供新的途径,也有助于分析肿瘤患者预后,进而改善膀胱癌患者的治疗效果。MicroRNA(mi RNA)是一类微小的内源性非编码的RNA,通过与靶基因mRNA的3’端非翻译区结合,降解mRNA或/和抑制mRNA翻译来抑制靶基因的表达。很多研究表明miRNA在肿瘤中异常表达,在肿瘤的发生发展中起着重要作用。miR-612对很多肿瘤具有抑制作用,如肝癌,结直肠癌等,但miR-612对膀胱癌的作用暂时无报道,本研究的目的为,验证miR-612靶向调控ME1,并进一步阐述这种靶向调控作用对膀胱癌细胞的影响,以及初步研究其可能的作用的机制。方法采用Real-time PCR检测miR-612在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达差异,和膀胱癌TNM分期、远处转移的关系,以及在永生化尿路上皮细胞和膀胱癌细胞系中的表达差异。通过lipofectamine 3000转染miR-612 mimic和miR-NC进膀胱癌细胞系T24细胞,并通过Real-time PCR验证miR-612过表达。采用CCK-8法、平板克隆形成、Transwell实验等方法对miR-612过表达后的细胞进行实验,从细胞增殖,克隆形成,迁移,侵袭等方面来检测miR-612对膀胱癌细胞T24生物学行为的影响,并通过裸鼠体内实验验证miR-612过表达后对肿瘤形成的抑制作用。同时用Western blooting实验探究过表达miR-612后对EMT(上皮间质化)进程的影响。通过DIANAmT,miRanda,miRDB,miRWalk,PICTAR5,RNA22 and TargetScan等软件预测miR-612可能的靶基因,之后通过Real-time PCR验证miR-612过表达后表达下降的靶基因,并通过western blot和Luciferase reporter assays进一步验证出miR-612的靶基因ME1。使用小干扰RNA(siRNA)干扰ME1表达后研究ME1对膀胱癌细胞T24的生物学特性以及对EMT的影响通过rescue实验,在将miR-612 mimic转染进T24细胞过表达miR-612的同时转染ME1过表达的质粒,进一步验证miR-612的靶基因是ME1。结果miR-612在膀胱癌组织中的表达低于癌旁组织,在膀胱癌细胞(5637、J82,UMUC3、T24)中的表达低于永生化尿路上皮细胞SV-HUC-1,且在T24细胞中的表达最低;同时,膀胱癌的TNM分期越高,miR-612的表达反而越低,发生远处转移的膀胱癌标本相比未发生转移的膀胱癌标本中miR-612的表达要高;成功将miR-612 mimic和miR-NC通过lipofectamine 3000转染进T24细胞;过表达miR-612对膀胱癌具有抑制作用,抑制膀胱癌T24细胞增殖和克隆形成,抑制细胞迁移和侵袭;T24细胞过表达miR-612后相比miR-NC组,EMT的分子标志物N-cadherin、Vimentin和MMP9显著降低,而E-cadherin显著升高;通过DIANAmT,miRanda,miRDB,miRWalk,PICTAR5,RNA22 and TargetScan等软件预测及Real-time PCR,western blot和Luciferase reporter assays成功找到并验证出ME1是miR-612的一个有效靶基因;ME1在膀胱癌肿瘤的表达高于癌旁组织中的表达。通过siRNA干扰细胞中ME1的表达后对T24细胞产生与miR-612过表达后相似的作用;Rescue实验表明ME1过表达能部分抵消miR-612对膀胱癌细胞T24的抑制作用。结论miR-612在膀胱癌中低表达可作为潜在的诊断膀胱癌的指标。miR-612在膀胱癌中起到抑制细胞生长,迁移,侵袭等作用并抑制EMT的进程,与干扰ME1表达的结果相似。我们的研究首次揭示了miR-612在膀胱癌细胞中调控ME1从而对膀胱癌的生物学行为进行调控的潜在机制,可能为膀胱癌的治疗提供新的思路。
摘要第6-9页
Abstract第9-11页
第1章 引言第13-14页
第2章 miR-612在膀胱癌组织和细胞中的表达情况第14-22页
    2.1 材料与方法第14-18页
        2.1.1 实验材料第14-15页
        2.1.2 实验方法第15-18页
        2.1.3 统计学分析第18页
    2.2 结果第18-20页
    2.3 讨论第20-21页
    2.4 小结第21-22页
第3章 miR-612在膀胱癌细胞中的功能研究第22-32页
    3.1 材料和方法第22-27页
        3.1.1 实验材料第22-23页
        3.1.2 实验方法第23-27页
        3.1.3 统计学分析第27页
    3.2 结果第27-31页
    3.3 讨论第31页
    3.4 小结第31-32页
第4章 ME1,miR-612的靶基因第32-40页
    4.1 材料和方法第32-36页
        4.1.1 实验材料第32页
        4.1.2 实验方法第32-36页
        4.1.3 统计学分析第36页
    4.2 结果第36-38页
    4.3 讨论第38-39页
    4.4 小结第39-40页
第5章 ME1介导miR-612对膀胱癌细胞的抑制作用第40-49页
    5.1 抑制ME1的表达对膀胱癌细胞生物学行为的影响第40-44页
        5.1.1 材料和方法第40-41页
            5.1.1.1 实验材料第40页
            5.1.1.2 实验方法第40-41页
            5.1.1.3 统计学分析第41页
        5.1.2 结果第41-44页
    5.2 过表达ME1部分回复miR-612对膀胱癌细胞的抑制作用第44-47页
        5.2.1 材料和方法第44-45页
            5.2.1.1 实验材料第44页
            5.2.1.2 实验方法第44-45页
            5.2.1.3 统计学分析第45页
        5.2.2 结果第45-47页
    5.3 讨论第47-48页
    5.4 小结第48-49页
第6章 miR-612通过靶向调控ME1影响EMT进程第49-53页
    6.1 材料和方法第49-50页
        6.1.1 实验材料第49页
        6.1.2 实验方法第49页
        6.1.3 统计学分析第49-50页
    6.2 结果第50-51页
    6.3 讨论第51-52页
    6.4 小结第52-53页
第7章 结论与展望第53-54页
    7.1 结论第53页
    7.2 进一步工作的方向第53-54页
参考文献第54-60页
附录第60-62页
    个人简历第60-61页
    在学期间的研究成果第61-62页
致谢第62-63页
综述第63-67页
    参考文献第66-67页
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