从EMT角度探讨六味地黄汤干预5/6肾切除大鼠慢性肾衰的机制

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目的:研究5/6肾切除慢性肾衰竭大鼠肾小管上皮细胞EMT致肾间质纤维化的机理,探讨六味地黄汤抗肾间质纤维化的疗效机制。方法:将健康雄性Sprapue-Demey大鼠随机分成正常组、假手术组、手术组。实验大鼠适应性喂养一周,采用5/6肾切除法复制慢性肾衰竭大鼠模型,手术组均在无菌条件下进行左肾上、下极切除,假手术组仅打开腹腔,正常组不作任何处理。右肾摘除1周后,把存活的手术组大鼠随机分为模型组、六味地黄汤组。六味组每天用六味地黄汤灌胃,模型组、假手术组和正常组以蒸馏水灌胃。连续灌胃8周后处死所有动物。于造模前、造模后1至9周,每2周称重一次。动物处死前收集尿液进行24h尿量及尿蛋白定量检测,收集血液检测BUN和CR水平,同时用HE染色、Masson染色观察左残肾组织形态学改变、用免疫组织化学、Western Blot、RT-PCR的方法分别检测大鼠留存肾组织中E-cadherin、α-SMA、FSP-1、TGF-β1BMP-7在蛋白水平和mRNA水平表达的差异,在细胞形态和分子生物水平的不同表达。结果:①与正常组比较:模型组体重随喂养时间延长缓慢增加,但增长速度明显迟后,差异具有统计学意义(P<0.01);24h尿量及尿蛋白定量均明显增高(P<0.01);肾功能指标BUN、Cr均升高(P<0.01);留存肾肉眼改变为质地硬韧,被膜不易剥离,切面肾皮质变薄,镜下改变为被膜纤维增厚,大部分肾小球萎缩、纤维化,肾小囊狭窄,少部分肾小球肥大,大部分肾小管上皮细胞萎缩、脱落,部分管腔不规则、扩张,管内存在大量蛋白质,肾间质有大量纤维结缔组织增生,出现明显的肾纤维化;模型组在蛋白水平和mRNA水平,上皮细胞标志物E-cadherin表达量明显下调,肌成纤维细胞标志物α-SMA、FSP-1表达量均明显上调,以上组间的差异均具有显著统计学意义(P<0.01),出现EMT现象,而TGF-β1表达水平上调,BMP-7表达水平下调,差异具有统计学意义(P<0.01);②经六味地黄汤治疗8周后,与模型组比较:六味组大鼠体重增加明显,24h尿量及尿蛋白定量降低,BUN降低,以上组间差异均具有统计学意义(P<0.05),肾间质纤维化程度减轻,在蛋白水平和mRNA水平,E-cadherin表达量上调,a-SMA. FSP-1表达量均下调,EMT现象减轻,而TGF-β1表达水平下调,BMP-7表达水平上调,以上组间的差异具有统计学意义(P<0.01)。以上所有实验结果中,假手术组与正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:①成功复制大鼠5/6肾切除致慢性肾衰竭模型;②证实大鼠5/6肾切除致慢性肾衰竭模型留存肾中存在EMT现象;③大鼠5/6肾切除致慢性肾衰竭模型留存肾中的EMT可能与TGF-β1表达水平上调,BMP-7表达水平下调有关;④六味地黄汤可减轻留存肾组织病理变化,延缓肾间质纤维化;⑤六味地黄汤可抑制EMT;⑥六味地黄汤可能通过下调TGF-β1表达水平,上调BMP-7表达水平,达到抑制EMT,抗肾间质纤维化的疗效机制。
本研究得到了以下课题项目的资助第6-7页
英文縮略词一览表第7-8页
中文摘要第8-10页
ABSTRACT第10-12页
引言第13-15页
第一部分 5/6肾切除大鼠致慢性肾衰竭模型制备第15-26页
    1. 材料第15-16页
    2. 方法第16-18页
    3. 结果第18-21页
    4. 讨论第21-26页
第二部分 六味地黄汤对慢性肾衰竭大鼠留存肾形态学的影响第26-32页
    1. 材料第26页
    2. 方法第26-28页
    3. 结果第28-30页
    4. 讨论第30-32页
第三部分 六味地黄汤对慢性肾衰大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响第32-61页
    1. 免疫组织化学法检测E-cadherin、α-SMA和FSP-1蛋白的表达第32-36页
        1.1 材料第32页
        1.2 方法第32-33页
        1.3 结果第33-36页
    2. WestBlot方法检测E-cadherin、α-SMA和FSP-1蛋白的表达第36-46页
        2.1 材料第36-40页
        2.2 方法第40-44页
        2.3 结果第44-46页
    3. RT-PCR方法检测E-cadherin、α-SMA和FSP-1 mRNA的表达第46-53页
        3.1 材料第46-48页
        3.2 方法第48-50页
        3.3 结果第50-53页
    4. 讨论第53-61页
第四部分 TGF-β1和BMP-7对六味地黄汤干预慢性肾衰大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响第61-71页
    1. 免疫组织化学法检测TGF-β1和BMP-7蛋白的表达第61-63页
        1.1 材料第61页
        1.2 方法第61页
        1.3 结果第61-63页
    2. Western blot方法检测TGF-β1和BMP-7蛋白的表达第63-65页
        2.1 材料第63页
        2.2 方法第63页
        2.3 结果第63-65页
    3. RT-PCR方法检测TGF-β1和BMP-7 mRNA的表达第65-67页
        3.1 材料第65页
        3.2 方法第65页
        3.3 结果第65-67页
    4. 讨论第67-71页
第五部分 结论第71-72页
附图第72-90页
参考文献第90-103页
综述第103-113页
    参考文献第110-113页
致谢第113-114页
攻读学位期间主要研究成果及发表论文第114-115页
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