目的:过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC1α)是一种多功能转录调节共激活因子,参与调节一系列代谢过程。PGC1α以特殊的组织模式表达,在不同的刺激下被诱导或激活,同这些组织中特定的转录因子共同调节各种生物学功能。饥饿状态下,肝脏强烈诱导PGC1α的表达,PGC1α通过与肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)或其他转录因子相互作用,促进糖异生基因的表达和增加肝脏葡萄糖输出。在肝癌细胞中PGC1α可辅助激活HNF4α促进许多HNF4α靶基因如鸟氨酸转氨甲酰酶(ornithine transcarbamylase,OTC)的表达,但PGC1α和HNF4α调控OTC表达的具体机制尚不明了。本研究旨在探讨PGC1α和HNF4α调控人OTC基因表达的机制。方法:Western Blot检测人永生化肝细胞HL-7702细胞株和3种肝癌细胞株BEL-7404、Huh7、Hep G2中HNF4α、PGC1α和OTC蛋白表达水平。Western Blot检测腺病毒介导的PGC1α过表达与si RNA介导的PGC1α沉默对HL-7702细胞、Hep G2细胞、BEL-7404细胞及Huh7细胞OTC蛋白表达的影响。采用PCR扩增长度为2071bp的人OTC启动子片段(-2050bp~+21bp),并将其克隆入荧光素酶报告载体p GL4.10。构建OTC启动子不同长度的短截荧光素酶报告载体,与PGC1α和(或)HNF4α表达质粒共转染BEL-7404细胞,培养48h后检测各报告载体荧光素酶活性,确定OTC启动子中PGC1α和HNF4α作用的活性区域,并通过生物信息学分析预测该区域的HNF4α结合位点,通过重叠延伸PCR构建突变型OTC启动子荧光素酶报告载体,与PGC1α和(或)HNF4α表达质粒共转染时检测各突变型OTC启动子荧光报告载体荧光素酶活性,确定HNF4α结合位点在PGC1α和HNF4α调控OTC启动子转录活性中的作用。凝胶迁移阻滞实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀(Ch IP)验证HNF4α与OTC启动子HNF4α结合位点的结合。结果:HNF4α蛋白在四株肝系细胞中均高表达,PGC1α蛋白和OTC蛋白在Hep G2细胞及HL-7702细胞中低表达,而在BEL-7404细胞及Huh7细胞中表达较高;腺病毒介导的PGC1α过表达使Hep G2细胞和HL-7702细胞OTC蛋白表达水平明显升高(P<0.05),而si RNA介导的PGC1α基因沉默使BEL-7404细胞和Huh7细胞OTC蛋白表达水平明显降低(P<0.05);HNF4α可上调人OTC启动子荧光素酶活性(P<0.05),PGC1α可明显增强HNF4α对人OTC启动子的转录激活作用,HNF4α对人OTC启动子的转录激活作用可随PGC1α浓度的升高而增强;发现人OTC启动子-165bp到-90bp区域存在两个HNF4α结合位点,证实转录因子HNF4α与人OTC启动子-165bp到-90bp区域两个HNF4α结合位点相结合,PGC1α与HNF4α结合于OTC启动子相同位置。结论:1.上调PGC1α在细胞内的表达可以促进OTC蛋白表达,而下调PGC1α在细胞内的表达可以抑制OTC蛋白表达。2.转录因子HNF4α可以反式激活人OTC启动子,共激活因子PGC1α可以进一步增强HNF4α的反式激活作用。PGC1α辅助激活HNF4α结合于人OTC近端启动子(-165bp~-90bp)两个HNF4α结合位点,增强OTC启动子活性。
