重症失血性休克及复苏条件下大鼠VAP-1表达规律及调控机制研究
重症休克论文 血管粘附蛋白-1论文 含铜胺氧化酶-3论文 氨基脲敏感性胺氧化酶论文 大鼠肝血窦内皮细
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【背景】基于目前重度失血性休克救治中靶向治疗手段的缺乏,以及创伤失血性休克相关基础研究与临床的脱节,急切需要我们重新审视已知对创伤失血性休克病理的认识。前期,我们在一种相对接近临床的肝左外叶切除+2.5ml/100g(体重)的大鼠创伤失血性休克模型上,摸索到24小时死亡率接近50%的干预条件,之后对存活和死亡大鼠失血前肝脏进行表达谱基因研究,筛查出约100个差异基因,随后对这些差异基因进行调控网络分析。数据表明有18个基因参与了这些差异基因的网络调控,结合专业知识,AOC3基因由于其编码蛋白具有细胞粘附功能及SSAO活性而进入我们视野。AOC3基因所编码的蛋白是一个由763个氨基酸组成的含铜胺氧化酶(CAOs),称为VAP-1。VAP-1是一种具有双重功能的蛋白。一方面作为内皮细胞粘附因子(VAP-1)可诱导白细胞粘附至血管内皮;另一方面作为胺氧化酶(SSAO)可催化芳香族和脂肪族的伯胺类物质转化成相应的醛类,并产生H2O2和NH3。通过文献复习我们发现VAP-1蛋白的功能与重症休克期微循环障碍及血管反应性降低有密切联系。因此我们认为VAP-1在重症休克病理过程中可能具有重要意义,有必要进行研究阐明,以期为临床救治重症休克提供一种新的治疗手段。【目的】1、明确大鼠定压失血性休克-复苏过程中肝脏组织AOC3基因及其编码蛋白VAP-1表达的变化规律;2、明确大鼠定压失血性休克-复苏过程中血液中sVAP-1含量及SSAO酶活性的变化规律;3、构建AOC3过表达腺病毒载体,为下一步体外功能实验奠定基础;4、检测AOC3过表达重组腺病毒对大鼠肝血窦内皮细胞的转染作用;5、明确低氧环境中大鼠肝血窦内皮细胞AOC3基因及其编码蛋白VAP-1的表达规律。【方法】1、大鼠定压失血性休克模型的建立;2、通过大鼠定压失血性休克模型在休克-复苏过程中的既定时间点采集大鼠肝脏组织标本,通过Real-time PCR、Western-Blot及免疫组化等方法检测休克-复苏各阶段AOC3基因及其编码蛋白VAP-1的表达情况;3、通过大鼠定压失血性休克模型采集大鼠休克-复苏既定时间点的外周血,使用ELISA法及分光光度计分别检测休克-复苏过程不同阶段sVAP-1含量及SSAO酶活性;4、AOC3过表达腺病毒载体的设计、构建、病毒包装、大量扩增、浓缩及滴定测定,用腺病毒转染大鼠肠微血管内皮细胞并测定MOI值;5、用重组腺病毒及空病毒转染大鼠肝血窦内皮细胞,并通过降低细胞培养箱氧浓度制造低氧环境。使用Real-time PCR、Western-Blot检测大鼠肝血窦内皮细胞在腺病毒转染前后在常氧条件及低氧条件下其AOC3基因及编码蛋白VAP-1的表达情况。【结果】1、建立了稳定的大鼠定压失血性休克模型;2、在定压失血性休克-复苏过程中,Real-time PCR结果显示肝脏组织AOC3基因表达量休克组显著高于复苏组及对照组,复苏组显著高于对照组;3、在定压失血性休克-复苏过程中, Western-blot结果显示在肝脏组织VAP-1/GAPDH蛋白浓度比值休克组显著高于复苏组及对照组,复苏组明显高于对照组;4、大鼠定压失血性休克-复苏过程中,ELISA定量结果显示血清中sVAP-1含量休克组显著高于复苏组及对照组,复苏组显著高于对照组。SSAO酶活性测定结果显示血清中酶活性休克组显著高于复苏组及对照组,复苏组显著高于对照组;5、成功建立AOC3过表达腺病毒载体(pIRES-EGFP-AOC3),重组腺病毒感染大鼠肠微血管内皮细胞的MOI值选取5-10为最佳;6、在常氧及低氧培养条件下,Real-time PCR结果均显示大鼠肝血窦内皮细胞经重组腺病毒转染后其AOC3表达量显著高于转染前,而该细胞经空病毒转染前后的AOC3表达量无显著差异。Western-blot结果显示相同的趋势;7、Real-time PCR结果显示无论大鼠肝血窦内皮细胞是否经重组腺病毒或空病毒转染,在低氧培养条件下其AOC3表达量均显著高于常氧培养条件。Western-blot结果虽然显示相同的趋势,但差异并不如Real-time PCR结果显著。【结论】1、体内试验证实大鼠重症休克病程中肝脏组织及血清中VAP-1的含量升高,血清中SSAO酶活性增强,而随着复苏的进行,各组织中VAP-1含量及SSAO酶活性均有下降趋势。2、AOC3过表达腺病毒载体构建成功。在常氧或厌氧条件下,大鼠肝血窦内皮细胞经AOC3过表达重组腺病毒转染后其AOC3基因及编码蛋白VAP-1表达量均有明显上升。3、在大鼠肝血窦内皮细胞经AOC3过表达重组腺病毒转染前后,其在低氧条件下AOC3的表达量均明显高于常氧状态下。其编码蛋白VAP-1表现同种趋势,然而该变化不如基因层面明显。
中文摘要 | 第6-9页 |
英文摘要 | 第9-12页 |
缩略词表 | 第13-17页 |
前言 | 第17-24页 |
参考文献 | 第20-24页 |
第一部分 定压失血性休克大鼠模型的建立 | 第24-36页 |
引言 | 第24-25页 |
实验 定压失血性休克大鼠模型的建立 | 第25-34页 |
讨论 | 第34-35页 |
参考文献 | 第35-36页 |
第二部分 重症休克及复苏条件下大鼠VAP-1蛋白的表达规律及意义 | 第36-78页 |
引言 | 第36-37页 |
实验一 大鼠肝脏组织AOC3基因mRNA相对含量测定 | 第37-47页 |
实验二 Western blot 检测大鼠肝脏组织中目的蛋白含量 | 第47-57页 |
实验三 大鼠肝脏组织中 VAP-1 蛋白的免疫组化检测 | 第57-63页 |
实验四 大鼠血清 VAP-1 含量及 SSAO 酶活性检测 | 第63-71页 |
讨论 | 第71-74页 |
参考文献 | 第74-78页 |
第三部分 大鼠AOC3过表达腺病毒载体的构建和鉴定 | 第78-113页 |
引言 | 第78-79页 |
实验一 大鼠AOC3过表达腺病毒载体设计和构建 | 第79-92页 |
实验二 大鼠AOC3过表达腺病毒包装 | 第92-101页 |
实验三 AOC3 过表达腺病毒的大量扩增、浓缩及滴定测定 | 第101-107页 |
实验四 腺病毒感染大鼠肠微血管内皮细胞的MOI值测定 | 第107-111页 |
讨论 | 第111-112页 |
参考文献 | 第112-113页 |
第四部分 缺氧条件下大鼠肝血窦内皮细胞VAP-1蛋白的表达规律及意义 | 第113-136页 |
引言 | 第113-114页 |
实验一 大鼠肝血窦内皮细胞 AOC3 基因 mRNA 相对含量测定 | 第114-125页 |
实验二 Western blot 检测大鼠肝血窦内皮细胞中目的蛋白含量 | 第125-132页 |
讨论 | 第132-134页 |
参考文献 | 第134-136页 |
全文总结 | 第136-137页 |
文献综述 | 第137-149页 |
参考文献 | 第142-149页 |
在读期间发表论文 | 第149-150页 |
致谢 | 第150页 |
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