猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗株基质膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白基因的研究
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本课题在猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)弱毒疫苗株克隆和鉴定的基础上,着重进行了PRRS病毒膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白基因的研究,主要包括以下几个方面: 一、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗弱毒株的克隆与鉴定 将从美洲和欧洲引进的2个PRRSV疫苗株进行了培养复壮,探讨了2个疫苗株的生长特征。并对美洲弱毒株进行了克隆、筛选和鉴定。克隆毒株最适宜生长的是MARC145细胞系,毒价可达107TCID50/ml,超薄切片电镜观察病毒子呈球形,大小50—60nm。同时探讨了PRRSV弱毒株的免疫特性。 二、PRRSV弱毒株M和N基因的克隆与鉴定 以PRRSV美洲毒株MN基因序列为模板、设计的一对能够合成MN基因的引物。采用RT—PCR成功扩增出一约900bp MN基因片段,构建了2个重组质粒PBVMN和PB-SMN。经酶切和部份序列测定得到证实。 三、PRRSV弱毒株M和N基因的序列分析 将MN基因的重组质粒PBSMN进行了完整的序列分析,阐明了PRRSV弱毒疫苗克隆株MN基因的分子特征。M和N基因分别位于ORF6和ORF7,以8bp重迭而相连,分别有一个起始密码子和终子密码子,N基因上游13个核苷酸有一前导序列基元的结合位点。与其它毒株比较,PRRSVMc与美洲毒株同源性较高(92—97%),与欧洲毒株同源性较低(60—67%)。M基因比N基因更保守。分析了常见的46种内切酶,发现在MN基因段有17个内切酶34个酶切位点。 四、PRRSVMc MN基因的表达 将重组质粒PBVMN进行了温敏诱导。SDS—PAGE电泳发现有一个约34KD的表达蛋白带,约占整个菌体的12%,但此表达蛋白免疫原性较差,Western—blot分析未出现阳性反应。 五、应用RT—PCR直接检测流产胎儿组织中的PRRSV,利用设计的能够扩增MN基因的引物和建立的RT—PCR方法,对可疑PRRSV感染的流产胎儿病理组织进行了检测,扩增出了与理论设计同样大小的cDNA片段。RT—PCR阳性标本通过病毒分离得到证实。
致谢 | 第7-8页 |
内容提要 | 第8-9页 |
引言 | 第9-11页 |
第一篇 文献综述 | 第11-39页 |
第一章 猪繁殖与呼吸综合征研究进展 | 第11-39页 |
一 发生历史 | 第11-12页 |
二 经济影响 | 第12页 |
三 病原 | 第12-17页 |
四 流行病学 | 第17-18页 |
五 临床症状 | 第18-19页 |
六 病理学 | 第19-21页 |
七 诊断 | 第21-25页 |
八 免疫学 | 第25-26页 |
九 防制 | 第26-27页 |
十 结语 | 第27-28页 |
参考文献 | 第28-39页 |
第二篇 研究内容 | 第39-95页 |
第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗弱毒株的克隆与鉴定 | 第39-48页 |
摘要 | 第39-40页 |
一 材料与方法 | 第40-41页 |
1 毒株 | 第40页 |
2 细胞 | 第40页 |
3 PRRSV弱毒的培养 | 第40页 |
4 PRRSV弱毒的克隆 | 第40页 |
5 PRRSVMc TCID_(50)测定 | 第40页 |
6 电镜标本的制备 | 第40页 |
7 ELISA抗原的制备 | 第40-41页 |
8 参考血清 | 第41页 |
9 ELISA试验 | 第41页 |
二 结果 | 第41-44页 |
1 PRRSV培养结果 | 第41页 |
2 PRRSV的克隆与纯化 | 第41-44页 |
3 PRRSVMc电镜形态结构 | 第44页 |
4 ELISA试验鉴定 | 第44页 |
三 讨论 | 第44-45页 |
参考文献 | 第45-47页 |
英文摘要 | 第47-48页 |
第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒基质膜蛋白和核衣壳蛋白基因的克隆与鉴定 | 第48-60页 |
摘要 | 第48-49页 |
一 材料与方法 | 第49-52页 |
1 毒株来源 | 第49页 |
2 PCR引物的设计与合成 | 第49页 |
3 PRRSVMc的提纯和RNA的制备 | 第49页 |
4 反转录(RT) | 第49-50页 |
5 PCR反应 | 第50页 |
6 PCR产物凝胶电泳 | 第50页 |
7 PRRSVMc MN基因的克隆 | 第50-51页 |
8 MN基因的亚克隆 | 第51-52页 |
9 部分序列测定鉴定 | 第52页 |
二 结果 | 第52-54页 |
1 PCR扩增产物及其重组质粒的初步鉴定 | 第52-53页 |
2 PRRSVMc MN基因的部分序列 | 第53-54页 |
三 讨论 | 第54-57页 |
参考文献 | 第57-59页 |
英文摘要 | 第59-60页 |
第四章 猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因序列分析 | 第60-79页 |
摘要 | 第60-61页 |
一 材料与方法 | 第61-63页 |
1 毒株来源 | 第61页 |
2 引物的设计与合成 | 第61页 |
3 病毒提纯及RNA的制备 | 第61页 |
4 PBVMN表达载体的构建 | 第61页 |
5 PBSMN重组质粒的构建 | 第61页 |
6 PBSMN MN基因序列分析 | 第61-63页 |
二 结果 | 第63-73页 |
1 MN蛋白基因的扩增与克隆 | 第63-64页 |
2 PRRSVMc MN基因序列测定结果 | 第64-66页 |
3 PRRSVMc MN基因与其它毒株MN基因序列比较 | 第66-70页 |
4 PRRSVMc MN基因推导的氨基酸序列与PRRSV美洲毒株和欧洲毒株的比较 | 第70-71页 |
5 PRRSVMc MN基因酶切位点分析 | 第71-73页 |
三 讨论 | 第73-75页 |
参考文献 | 第75-78页 |
英文摘要 | 第78-79页 |
第五章 猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达 | 第79-89页 |
摘要 | 第79页 |
一 材料与方法 | 第79-82页 |
1 病毒和细胞 | 第79页 |
2 载体和宿主菌 | 第79页 |
3 酶及化学试剂 | 第79-80页 |
4 引物的设计与合成 | 第80页 |
5 病毒的培养和RNA的制备 | 第80页 |
6 PRRSV高免血清的制备 | 第80页 |
7 PBVMN表达质粒的构建 | 第80-81页 |
8 MN蛋白的表达及鉴定 | 第81-82页 |
二 结果 | 第82-84页 |
1 RT-PCR扩增产物及其重组质粒鉴定 | 第82-84页 |
2 SDS-PAGE和免疫印迹 | 第84页 |
三 讨论 | 第84-85页 |
参考文献 | 第85-88页 |
英文摘要 | 第88-89页 |
第六章 应用RT-PCR直接检测流产胎儿组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒 | 第89-95页 |
摘要 | 第89页 |
一 材料与方法 | 第89-91页 |
1 病毒样品制备 | 第89-90页 |
2 RNA制备 | 第90页 |
3 引物设计 | 第90页 |
4 反转录(RT) | 第90-91页 |
5 PCR反应 | 第91页 |
6 病毒分离鉴定 | 第91页 |
二 结果 | 第91-92页 |
三 讨论 | 第92页 |
参考文献 | 第92-94页 |
英文摘要 | 第94-95页 |
结语 | 第95页 |
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