水稻是全球半数多人口的主食,随着人们生活水平的日益提高,消费者对稻米品质也提出了更高要求。水稻香味是高档优质米的一个重要品质性状;香稻米质优良,香味馥郁,兼具食疗保健作用,愈来愈受到消费者的青睐和市场欢迎。本文以优良籼稻保持系川香29B（或其恢复系29R）为香味供体亲本,美国光身粳稻Lemont、R2（由Lemont选育而来）、美B、P18和G46B为受体亲本,对川香29香味性状进行了遗传分析、基因定位、分子标记辅助选择及基因芯片等多方面的分析,主要结果如下:1.川香29B香味遗传分析与基因定位1.1水稻叶片香味氢氧化钾法鉴定香味是感官性状,其表型鉴定受到外界气候环境诸多影响。以有香味亲本和无香味亲本为对照,对其后代分离群体用氢氧化钾法鉴定叶片香味。通过在不同时间、地点和气候环境下多年试验,发现用氢氧化钾法鉴定水稻叶片香味的最佳时机为雨过天晴后的上午,温度在20～26℃,该时期两对照亲本鉴别的准确率在99%以上,后代分离单株香与不香性状表现非常明显。1.2川香29B香味性状遗传分析川香29B/Le,29B╱R2两组合杂交种F1种子经咀嚼米粒香味鉴定没有香味,其F1植株叶片也均表现没有香味,即川香29B香味性状受隐性基因控制:在这两个F2群体中,经x2测验,无香味单株与极端香味单株分离比符合3:1,该结果由相应F2:3家系香味表型进一步得到验证,表明川香29B香味性状受一对单隐性基因控制。1.3香味基因分子标记定位在均匀分布于水稻12条染色体上700对SSR引物中,有268对在29B与Lemont存在多态性,多态性频率为38.29%。其中位于第8染色体上的RM23097、RM515、RM8264、RM7049、RM7356和RM7556等标记与香味性状存在连锁。本研究开发SSR标记Aro1和Aro7在这两亲本间也存在多态性,香味基因fgr被定位在SSR标记Aro7（0.57cM）和RM515（0.71cM）之间。在29B/R2 F2群体中,将香味基因fgr定位于RM23120（0.52 cM）和RM3459（1.23 cM）两标记之间。2.分子标记辅助选育香稻保持系与恢复系2.1香味基因连锁标记基因型鉴定前人报道的香味基因连锁标记RM223、和SCU-Rice-SSR-1在本研究亲本29B与Lemont中不存在多态性,RM42存在多态性但不与香味性状连锁。本研究所鉴定与香味基因连锁的8个标记在来自不同区域的13个香稻品种中基因型存在差异,因而对于香味基因的分子标记辅助选择,需要根据不同的香稻材料,确定选用的连锁标记及其对应的基因型。2.2水稻香味的ISSR分析从40条ISSR引物中筛选到的24个用于对目前生产应用较多的23份香稻与非香稻材料进行检测,共检测到208个多态性片段,扩增带的分子量在100～2200bp区间。不同引物扩增出的清晰多态条带数在5～16条之间（表2）,扩增出5～9条的引物有16个,占66.7%;扩增出10～16条的引物有8个,占33.3%,平均每个引物扩增到8.67个多态性带;ISSR标记能将23份水稻完全区分开。推测ISSR标记812中多态性条带（1050bp左右）可能与水稻香味性状有关。2.3分子标记辅助选育香稻保持系与恢复系以川香29B（或其恢复系29R）为供体亲本,无香味恢复系P18和无香味保持系美B分别为受体轮回亲本,获得P18/29R的F1和美B/29B组合的F2。用与香味基因紧密连锁的两侧标记RM23120和RM3459在P18/29R组合中选择香味纯合基因型单株;Aro1和RM3459在美B/29B组合中选择香味纯合基因型单株;同期进行农艺性状香味表型选择和遗传背景分析。此后经过成都正季和海南南繁一年两季,连续回交;获得一批目标基因纯合且农艺性状稳定的优良香稻保持系和恢复系。3.水稻香味的基因芯片分析3.1有香味与无香味近等基因池差异基因从29B近等基因系（NIL）BC6F3群体中选择遗传背景完全相同,只在目标基因型存在差异的有香味与无香味单株,其分蘖期叶片分别等量混合用于芯片分析。在第8染色体目标区域,芯片在有香味与无香味近等基因池检测到4个差异基因:AT3G48170（geneid）参与氨基乙酸、丝氨酸和苏氨酸新陈代谢;AT4G27070和AT5G54810参与苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成;AT4G34030参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的分化降解。其中AT3G48170即为前人报道的sk-2香味基因,也是本研究分子标记定位区域的基因。在分子功能（Go）和生物过程（Pathway）方面,芯片在水稻全基因组共检测到23个（不包括重复）差异基因。这些基因是一些转录启动激活、DNA控制的RNA酶活性和应激反应因子,主要参与生理生化调控和硫化物新陈代谢。进一步RT-PCR分析验证了该芯片结果的可靠性。3.2水稻香味机理及生化途径根据芯片结果,结合前人研究及生物信息学分析,发现胆碱是香味主基因sk-2调控中的重要物质。而胆碱（Choline）是维生素B复合体之一,该物质在水稻籽粒中主要存在谷壳和籽粒表面,从而找到了水稻米粒香味主要分布在表面的原因。在香稻材料中,BADH2基因第7外显子发生8个碱基的缺失与3个单核苷酸多态性,使终止密码子提前出现,BADH2基因不再编码甜菜碱脱氢酶（Betaine-aldehydedehydrogenase,BADH）,引起甜菜碱醛（Betaine aldehyde）到甜菜碱（Glycine betaine）氧化过程的终止。生成的甜菜碱醛便在胆碱脱氢酶（choline dehydrogenase）作用下,参与反应:Betaine aldehyde+FAD+H2O<=>FADH2+Betaine,该反应与脯氨酸降解Ⅰ存在FAD与FADH2的竞争,使L-脯氨酸积累,最终引起1-吡咯啉-2-羧酸盐的产生。推测香味主成分2-乙酰-1-吡咯啉是由1-吡咯啉-2-羧酸盐通过甲基化作用一步或多步反应而来。另外,硫化合物可能与水稻香味物质的形成和调控密切相关。
