[目的]复苏PC12细胞并传代培养,以三气培养箱制作PC12细胞缺氧／复氧模型,分别在缺氧2h、4h、8h、12h后,复氧2h,检测各时间点的细胞活力并检测各时间点的ALDH2表达情况,筛选出细胞活力较好而ALDH2表达较低的一个时间点(4h)用于后续检测。构建野生型pEGFP-N1-ALDH2真核表达载体以及突变型pEGFP-N1-ALDH2(AAA)真核表达载体,转染PC12细胞并进行转染后验证,以转染后PC12细胞进行缺氧/复氧,探讨ALDH2对PC12细胞缺氧损伤的保护作用。[方法]1.以快速溶解法复苏PC12细胞(分化),以1×105的细胞密度接种到6孔细胞培养板中,24h后换液去除DMSO。待细胞融合度达到90%左右时,0.25%胰酶消化、离心后进行传代培养。2.PC12细胞缺氧模型建立：①以三气培养箱制作PC12细胞缺氧／复氧模型,摸索达到最佳实验条件所需的O2与N2的比例。②分别在缺氧2h、4h、8h、12h后复氧2h,倒置显微镜下观察各时间点细胞生长情况,进行细胞计数并以MTT法检测各时间点的细胞活力。③收集各组细胞以Western Blot检测各时间点ALDH2的表达情况,筛选出细胞状态较好而ALDH2表达较低的一个时间点用于后续实验。3.构建重组质粒pEGFP-N1-ALDH2(野生型)和重组质粒pEGFP-N1-ALDH2(突变型,GAA→AAA),进行酶切鉴定并测序。4.以脂质体法(Lipofectamine LTX and plus)进行细胞转染,设不同转染试剂浓度和不同细胞密度分别将空白质粒(pEGFP-N1)、野生型质粒(pEGFP-N1-ALDH2)、突变型质粒(pEGFP-N1-ALDH2(AAA))转染PC12细胞,在倒置荧光显微镜下观察,确定达到最佳转染效率所需的细胞密度、质粒浓度等条件,以RT-PCR和Western Blot进行转染后验证。5.以最佳转染条件将三组质粒转染PC12细胞后进行缺氧条件培养,缺氧4h后复氧2h,对各组细胞进行计数并以MTT法检测各组细胞的细胞活力,收集细胞后对各组细胞进行Annexin V-FITC/PI染色,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。[结果]1.PC12细胞复苏并传代成功,倒置显微镜下观察细胞状态良好,透光性强,胞体椭圆,两侧有长的突起。2.①PC12细胞缺氧/复氧模型成功建立,选用5%C02+5%02+90%N2培养条件进行缺氧培养；②倒置显微镜下观察发现：与正常对照组相比,缺氧2h组的细胞形态无明显改变,缺氧4h组的PC12细胞突起变短,部分细胞死亡呈圆形浮起,8h组和12h组出现大量细胞死亡,呈圆形漂浮在培养液中；细胞计数结果显示：与正常组进行比较,缺氧2h组细胞数量无明显变化(p>0.05),缺氧4h、8h、12h组细胞数目均显著减少(p<0.05),8h组和12h组的细胞数量减少尤为显著(p<0.01)；MTT值检测结果显示：与正常组进行比较,缺氧2h组的细胞活力无明显改变(p>0.05),缺氧4h、8h、12h组的细胞活力均显著下降(p<0.05),其中8h组和12h组的细胞活力下降尤为显著(p<0.01);③estern Blot结果显示：与正常组比较,在缺氧2h组的ALDH2表达无明显差异(p>0.05),缺氧4h、8h、12h组的ALDH2蛋白表达明显减弱(p<0.05)；与缺氧4h比较,缺氧8h、12h的ALDH2蛋白表达减弱(p<0.05)。3.成功构建重组质粒pEGFP-N1-ALDH2(野生型)和重组质粒pEGFP-N1-ALDH2(突变型,GAA→AAA),酶切鉴定及测序正确。4.以梯度转染试剂转染PC12细胞后,倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况,筛选出各个质粒达到最佳转染效率所需的实验条件并以此重复转染细胞进行转染后验证,RT-PCR显示正常PC12细胞分别转染三种质粒后,野生型pEGFP-N1-ALDH2转染组的ALDH2的基因表达明显高于空白质粒组和突变型转染组(p<0.05)；Western Blot结果与RT-PCR实验结果相符。5.三组质粒以最佳转染条件转染PC12细胞后,进行缺氧4h/复氧2h实验,细胞计数结果提示：与单纯缺氧组比较,野生型ALDH2质粒转染后细胞数日有明显增多(p<0.05),空白质粒转染组细胞数目无明显差异(p=0.474,p>0.05),突变型ALDH2转染后比单纯缺氧组细胞数目有显著下降(p<0.05)；MTT值检测结果与细胞计数结果相符；流式细胞仪检测凋亡结果显示：与单纯缺氧组相比,野生型转染组缺氧处理4h后凋亡前期的细胞比例和凋亡后期的细胞比例均低于其它缺氧处理组(p<0.05)；而空质粒转染组和突变型转染组的细胞凋亡率无显著变化(p>0.05)。[结论]1.分化型PC12细胞的缺氧/复氧模型建立条件为5%C02+5%02+90%N2；2.重组质粒野生型(pEGFP-N1-ALDH2)和突变型(pEGFP-N1-ALDH2(AAA))可通过脂质体法转染进入PC12细胞；3.野生型ALDH2在PC12细胞的缺氧/复氧损伤过程中通过抑制凋亡,促进细胞存活发挥保护性作用。
