槐角(Sophorae Fructus)为豆科植物(Leguminosae sp.)槐(Sophora japonicaL.)的干燥成熟果实。是我国常用的传统中药之一,具有清热泻火,凉血止血的功效,用于肠热便血,痔肿出血,眩晕目赤等症。为《中华人民共和国药典》历版收载的品种。槐角富含黄酮、异黄酮类等多种成分,药理作用显著,临床应用广泛,具有极好的应用前景和开发前途。陕西为槐角的主产区,槐角多处于自然生长状态,分布广,来源复杂,对槐角相关的生物学特性、资源、品质、成分和生物活性等尚不十分清楚。因此,对陕西境内槐角的综合研究需要在已有基础上,进行更深入的物效基础和生物活性研究,扩大应用范围,为槐角的合理利用提供科学依据。本课题应用植物资源学、植物化学、药理学和分子生物学等多种技术方法,从资源、品质、化学成分和生物活性四个方面对陕西槐角进行了较系统的研究,包括对陕西境内槐角进行了实地资源调查,分析了不同来源槐角的品质,考察了槐角总黄酮栓的抗炎止血活性、槐角苷的提取分离、纯化、结构鉴定及其药代动力学特点、染料木黄酮对海马神经元的保护作用以及槲皮素对胰岛素淀粉样纤维形成的影响,在整体动物、细胞和分子水平上探讨了槐角活性成分的作用及其机制,以期为进一步开发陕西的槐角资源提供实验依据。研究的内容和结果如下：1.槐角资源调查：在查阅相关文献资料和核对标本的基础上,采用走访调查和实地调查相结合的方法进行槐角资源调查。结果显示：槐角的资源树种槐在陕西境内分布较广泛,多处于野生状态,其生长的植被主要为农耕地、荒地、田埂、道沿和部分天然草本群落。伴生植物主要为人工栽培的农作物、以及村镇林木,零星散在苜蓿、铁杆蒿、白羊草等草本。种质资源类型有白槐与黑槐之分,白槐是栽培的主要树种。样品区树龄均>20年,单株平均产量>200Kg,槐角在全省自然蕴藏量估算可达2100吨/年。随着城市化进程加快,槐角的原植物发生多方面的变化,包括成年植株移栽数量巨大、产量锐减(年递减率达到13%)、变种增多,这些都会影响到槐角的品质,因此需要加强野生槐角种质资源的收集、保存,并保护好现有资源。2.槐角品质评价：通过建立UV法和RP-HPLC法,分别测定了陕西不同地区槐角样品中总黄酮和槐角苷的含量,并检查了槐角中灰分和重金属含量,结合小鼠雌激素样作用考察,共同评价槐角的品质。结果显示,采用8倍量65%乙醇回流提取3次,每次1小时,为总黄酮提取的最佳条件,按此条件提取槐角总黄酮,平均得率在10.92-20.18%之间。槐角苷含量在4.21-8.05%之间。不同区域的槐角品质有一定差异,宝鸡陇县槐角中槐角苷含量最高,而杂质及重金属以延安宜川为最低。陕北黄土丘陵沟壑区9月的槐角样品中总黄酮含量较高；渭北黄土高原沟壑区则10-11月槐角中总黄酮含量较高。槐角提取物显示了一定的弱雌激素样作用,与空白对照组相比,在第3天就能促进小鼠阴道的开口数量,第7天达到54%,并能显著增加小鼠卵巢和子宫的重量(*P<0.05或**<0.01),其中延安宜川、渭南蒲城的槐角提取物雌激素样作用较强。3.槐角黄酮栓生物活性评价：槐角黄酮栓在一定程度上可减轻二甲苯所致小鼠耳廓肿胀,其中0.60g/kg及0.30g/kg在给药6d、9d、14d对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀有显著的抑制作用,与模型组相比具有极显著差异(**P<0.01),并表现出一定的量效关系。各剂量组均能明显减轻小鼠滤纸肉芽组织重量(**P<0.01),其中高剂量组抑制率在50%以上,与阳性药物阿司匹林组(0.50g/kg)作用接近。黄酮栓各剂量组对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高具有明的抑制作用(*P<0.05或**P<0.01),并表现出一定的量效关系,但弱于阿司匹林栓组。槐角黄酮栓能显著缓解角叉菜胶引起的大鼠足肿胀,与模型组比较有统计学意义(*P<0.05或**P<0.01)。从致炎后2h开始即显示有抑制作用,持续到4h时抑制作用更为明显,抑制率在40%以上。槐角黄酮栓也能缩短正常小鼠的出、凝血时间,与空白对照组比较差异明显(*P<0.05或**P<0.01)表明其具有促进止血、加强凝血的作用。槐角黄酮栓能使10%醋酸所致大鼠直肠渗出液减少,溃疡面积缩小,溃疡愈合时间缩短,与模型对照组比较,具有显著性差异(*P<0.05或**P<0.01),证明槐角黄酮栓具有抗直肠溃疡,保护创面的药理作用,有望开发成治疗痔疮的新药。4.槐角苷的分离、纯化、鉴定及药代动力学研究：建立了槐角中槐角苷含量测定的HPLC法,色谱条件为,流动相：甲醇-乙腈-10mL·L-1冰乙酸(40：5：55)；流速：1.0mL/min,检测波长：260nm,进样量为20gL,最低检出浓度为0.015μg/mL。该法灵敏、准确、可靠。采用正交试验法对槐角的提取工艺进行了考察,结果最佳提取条件为95%乙醇8倍量(W/V),提取3次,每次1.5小时。经对三批1000g槐角样品经过醇提、水沉淀、乙酸乙酯除杂、水洗步骤处理后,获得槐角苷的粗品,收率分别为1.326%、1.258%、1.203%；纯度分别为：85.21%、85.08%、84.46%。在此基础上,运用大孔树脂吸附的方法纯化槐角苷粗提物,考察了吸附条件,结果洗脱剂浓度为80%乙醇、流速以2BV/h,上样液质量浓度在1.0mg/mL能使槐角苷粗品的纯度由84.92%提高到了91.98%。采用甲醇热溶,丙酮沉淀、反复析晶的方法,获得了纯度>97%的槐角苷单体,通过理化性质和波谱学研究,证明获得的提取物为5,7-二羟基异黄酮-4’-O-葡萄糖苷,即槐角苷。首次建立HPLC测定大鼠血浆中槐角苷的定量分析方法,并通过尾静脉注射给药的方式来研究血药浓度变化规律,结果各取样时间点雌性大鼠血浆中原形药物的浓度要高于雄性大鼠,Cmax=2.531mg/L(雌)、Cmax=1.648mg/L(雄)。槐角苷雌性大鼠的达峰时间Tmax=10min,雄性大鼠Tmax=7min,雌性大鼠对药物的吸收速度明显要高于雄性大鼠。槐角苷原形药物在血浆中的代谢过程符合一室模型。大鼠槐角苷半衰期为t1/2=55.70min(雌),半衰期t1/2=23.14min(雄),说明槐角昔在雌性大鼠吸收、代谢均比雄性大鼠要慢。5.染料木黄酮对Aβ25-35引起海马神经元损伤的拮抗作用及机制研究：在获得槐角苷单体的基础上,用含10%HCl的50%乙醇在90℃热回流酸水解4h,10mol/L的NaOH溶液调pH为7,乙醚萃取,水洗,80℃干燥,甲醇重结晶,可以得到染料木黄酮单体,通过理化性质和波谱鉴定为5,7,4’-三羟基异黄酮,HPLC检测纯度>98%。以原代培养的大鼠海马神经元为研究对象,应用Aβ25-35处理海马神经元,观察从槐角中提取的染料木黄酮对Aβ25-35毒性的拮抗作用,结果显示：染料木黄酮能够显著改善Aβ25-35诱导引起的海马神经细胞形态的改变,减轻细胞膜的损伤,对抗Aβ引起的海马神经元活性降低,提高细胞的存活率,减少氧化损伤所致的细胞凋亡。与雌二醇相比,两者抗Aβ神经毒性作用的效果类同。染料木黄酮能抑制caspase-3酶活性,提高抑凋亡分子Bcl-2表达,对抗ROS和MDA的改变,提示染料木黄酮发挥神经保护作用可能与其抗氧化作用有关。此外,染料木黄酮还能拮抗Aβ所致的nAChR亚单位α7mRNA、蛋白表达的下调,使得海马细胞正常代谢活动得以维持,从而起到神经保护作用。6.槲皮素对牛胰岛素蛋白淀粉样纤维化的抑制作用研究：采用牛胰岛素作为模式蛋白,通过体外孵育,综合采用ThT荧光检测、透射电子显微镜观察、蛋白沉积率测定、溶血实验和蛋白凝胶电泳分别考察了槐角中提取的槲皮素抗蛋白淀粉样纤维形成的作用及其机制。结果显示,当浓度为25gg/mL或50μg/mL的槲皮素与胰岛素进行共孵育时,ThT荧光强度出现明显的剂量依赖减弱,使胰岛素纤维的ThT荧光特征S曲线消失。说明槲皮素对胰岛素淀粉样蛋白纤维形成具有良好的抑制效果。而用不同浓度(10、25、50μg/mL)的槲皮素处理成熟的胰岛素纤维,可以使胰岛素纤维的形貌受到破坏,电镜下观察为无具体形貌的小颗粒或无定形聚合物。用40μg/mL的槲皮素进行培育时,13%的胰岛素纤维在4h内转化成了无定形沉积物,槲皮素对胰岛素纤维抑制表现的沉积效应呈现出明显的时间和剂量依赖性。当与槲皮素进行同孵育后,由同等剂量胰岛素纤维引起的溶血现象受到抑制,并呈剂量依赖性的下降。凝胶电泳研究证明,胰岛素纤维可诱导血影蛋白质的聚集,而槲皮素减弱了胰岛素纤维诱导的高分子量聚合物的形成。疏水作用、芳香氨基酸重迭以及氢键结合可能是槲皮素发挥其抗淀粉样纤维化和破坏纤维形成作用的驱动力。
