背景心肌梗死后心脏重塑包括多个方面,如心肌细胞的凋亡和肥大,细胞外基质的合成和沉积,以及血管的新生。在心肌梗死的早期,细胞外基质的合成及沉积能加强局部的收缩力,形成瘢痕防止心脏破裂,改善心功能；然而在疾病的后期,过度的细胞外基质沉积则会引起心肌纤维化,导致心功能不全,最终造成心力衰竭。有研究发现,在心肌梗死区域,细胞外基质的合成和沉积会呈现一种持续的变化,即使在心梗后6个月直至数年时间,细胞外基质重塑仍处于激活状态。因此,如何成功调控心肌纤维化过程,成为改善心肌梗死预后的关键因素。对心肌纤维化的基因治疗刚刚处于起步阶段,microRNA (miRNA)作为能调控多个靶点的上游调控因子越来越受到关注。已有研究证明miRNA能够调控心脏中细胞外基质的合成及分解代谢过程,如miR-21和miR-29调控心脏成纤维细胞胶原合成,来调控心肌肥厚的纤维化过程。但相关miRNA调控心肌梗死后心肌纤维化过程的研究罕见报道。在前期研究中,通过对心肌肥厚心脏组织中心肌纤维化程度,及相关miRNA表达水平的检测,发现心脏重塑会导致心肌纤维化,部分与此相关miRNA发生了改变,其中miR-24簇在心脏肥厚组织中改变最为明显。研究目的：(1)明确miR-24对心脏成纤维细胞功能的影响,及其作用机制,为心肌纤维化的干预提供实验依据。(2)明确miR-24在心肌梗死后心脏重塑过程中的作用,为临床缺血性心脏病的治疗提供新的作用靶点。方法及结果：第一部分：miR-24通过Furin-TGF-β1通路调控心脏成纤维细胞的功能1.miR-24在心脏成纤维细胞中高表达。通过qRT-PCR方法检测心脏成纤维细胞和心肌细胞中miR-24的表达水平,显示miR-24在心脏成纤维细胞中高表达。2.miR-24调控心脏成纤维细胞的功能。2.1miR-24抑制心脏成纤维细胞胶原合成。miR-24前体或抑制剂转染心脏成纤维细胞,Western-blot及qRT-PCR检测显示,过表达miR-24能抑制心脏成纤维细胞1、3型胶原合成。2.2miR-24抑制心脏成纤维细胞分化成为肌样成纤维细胞。Western-blot及免疫组化结果显示,过表达miR-24能抑制肌样成纤维细胞的标记物a-SMA的表达。2.3miR-24抑制心脏成纤维细胞增殖及迁移能力。Transwell细胞迁移检测显示,过表达miR-24能抑制心脏成纤维细胞迁移；BrdU增殖检测显示miR-24能抑制心脏成纤维细胞的增殖。3.miR-24通过Furin-TGF-β1通路起作用。3.1TGF-β1刺激造成心脏成纤维细胞中miR-24表达升高。qRT-PCR检测显示,心脏成纤维细胞中加入TGF-β1能刺激miR-24表达升高,而且呈现一定的时间剂量依赖性。3.2miR-24抑制TGF-β1通路的功能。miR-24脂质体转染心脏成纤维细胞能抑制心脏成纤维细胞合成和分泌TGF-β1的能力,并影响其下游通路蛋白Smad2/3的磷酸化水平。3.3miR-24通过Furin蛋白起作用。通过表达谱芯片筛选及靶点数据库查找,推测Furin蛋白可能是miR-24的作用靶位点(Furin是一种蛋白酶,能作用于TGF-β的成熟过程)。经miRNA过表达及抑制实验证实miR-24能调控心脏成纤维细胞中Furin蛋白的表达水平。3.4Furin蛋白调控心脏成纤维细胞功能。构建Furin蛋白的小干扰RNA来抑制Furin表达,Western-blot和qRT-PCR检测转染siFurin后心脏成纤维细胞功能变化,结果显示抑制Furin表达能够抑制心脏成纤维细胞的分化和胶原合成能力。第二部分：miR-24改善心肌梗死后心脏重塑和心功能1.miR-24在心梗区域低表达。建立小鼠心肌梗死模型,qRT-PCR检测miR-24在心肌梗死部位及心梗周边区的表达,显示miR-24的表达在心肌梗死后显著降低,在心梗后1周最为明显,然后逐渐升高,于心梗4周后恢复正常。2.miR-24减少心梗面积,改善心功能。构建miR-24慢病毒,用慢病毒心梗周边区组织转染的方法过表达miR-24,结果显示miR-24能减少心梗2周后心梗面积,改善心功能。3.miR-24抑制心梗后心肌纤维化。miR-24转染能够减少心肌梗死2周后,心梗周边区及整体心脏Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的表达；减少成纤维细胞向肌样成纤维细胞的分化；并减少心梗区域心脏成纤维细胞的增殖。4. miR-24调控心梗后心肌细胞凋亡。心梗组织TUNNEL染色显示,miR-24转染可以减少心梗1周后细胞凋亡。缺氧、血清饥饿(H/SD)联合处理诱导心肌细胞凋亡,miR-24表达明显升高；转染miR-24能抑制H/SD导致的心肌细胞凋亡结论：在心脏成纤维细胞中,miR-24作用于靶点Furin蛋白来调控TGF-β1通路,进而调控心脏成纤维细胞的分化,增殖,迁移及合成胶原的能力。在小鼠心肌梗死模型中过表达miR-24能够减少心梗周边区的胶原沉积,并减少心肌细胞凋亡,进而减少心梗面积,改善心功能。这一研究能为心肌梗死的治疗及其他心脏疾病的抗纤维化治疗提供一个新的作用靶点。
