RNAi技术沉默玉米支链淀粉合成相关基因表达的研究

玉米是一年生禾本科单子叶植物，是我国重要的粮食作物，也是全世界粮食总产量最高的作物。玉米淀粉有直链淀粉和支链淀粉两种，直链淀粉广泛应用于食品、医疗用品、纺织等领域中，具有较高的商业价值，但仅占总淀粉含量的25%。因此，培育高直链淀粉玉米成为目前研究的主要内容。影响玉米淀粉生物合成的关键酶有四种：腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）、淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）和去分支酶（DBE）。本实验用RNAi技术成功构建了五个干扰载体。将SBE基因片段构建成发夹结构的表达载体pCAMB-RNAi-SBE，融合基因片段DBE::SSS构成的发夹结构的表达载体pCAMB-DBE::SSS，本实验首次将干扰基因片段（SBEIIb，DBE::SSS）和过表达基因（AGP）构建于同一个载体上：pCAMB-RSA和pCAMB-DBE::SSS-AGP，同时用overlap PCR方法构建SBE基因的人工microRNA干扰载体pCAMBI-miRNA(SBE)。从而使多基因同时转化玉米成为可能，并且为进一步提高玉米直链淀粉含量提供了理论和实践基础。同时初步优化并建立了一套较为稳定的玉米愈伤组织遗传转化体系。在30个玉米自交系中筛选出四D300作为后期遗传转化的受体，愈伤状态稳定，能够较好的分化出苗。通过农杆菌侵染法、花粉管通道法及显微注射法转化玉米，获得转基因植株共14株。在农杆菌侵染过程中，以pCAMBI-miRNA(SBE)为载体，用GUS瞬时表达来检测农杆菌侵染三种不同玉米组织的转化效率，结果发现：农杆菌侵染法转化玉米愈伤的初始转化效率最高，约为67.1%。并且获得了1株PCR检测为阳性的植株。GUS瞬时表达检测花粉管通道法及显微注射法（载体：pCAMBI-miRNA(SBE)）转基因的可行性时发现：花粉管通道法得到的转基因胚中能被染成蓝色，而显微注射法获得的种子中，在注射部位没有染成蓝色，在胚中观察到蓝色，具体的研究机理尚不清楚，有待进一步的研究。通过花粉管通道法转基因玉米，经PCR-southern检测为阳性的T0代植株12株，显微注射法获得PCR-southern检测为阳性的植株1株。T1代转基因玉米种子淀粉含量的测定结果表明：春317转基因籽粒的总淀粉含量与对照相比增加1.09~5.8%，春301转基因籽粒的总淀粉含量较对照增加0.59~2.53%。