草莓镶脉病毒侵染性克隆的构建及其ORF Ⅵ基因的原核表达

草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus, SVBV）是一种严重危害草莓的潜隐性病毒，在全世界范围内广泛分布，目前，SVBV在我国河南、河北、吉林等省都有报道，给我国草莓生产造成严重损失。SVBV属于花椰菜花叶病毒科花椰菜花叶病毒属，基因组为双链环状DNA，大小约为7.8kb，含有7个ORFs。为了深入研究SVBV在寄主体内的复制、移动以及病毒致病因子与寄主因子的相互关系，本研究构建了SVBV的侵染性克隆。另外，SVBV的致病性强弱与其ORF Ⅵ基因编码的P6蛋白密切相关，本研究克隆了SVBV的ORF Ⅵ基因并进行原核表达，制备出特异性抗血清，可为深入研究P6蛋白的具体功能奠定基础，对阐明病毒在寄主体内的致病机制具有重要意义。1. SVBV侵染性克隆的构建SVBV基因组全长7.8kb，pSVBV-E3为SVBV全基因组克隆，SVBV含有EcoR I和BamH I两个单酶切位点，首先利用EcoR I和BamH I双酶切pSVBV-E3，获得约4kb的0.5拷贝SVBV（0.5SVBV），将0.5SVBV插入到同样酶切的双元表达载体pBinPLUS，获得重组载体pBin-0.5SVBV。然后EcoR I单酶切pSVBV-E3，获得1拷贝的SVBV全长序列，将其正向插入到EcoR I酶切的pBin-0.5SVBV中，获得重组载体pBin-1.5SVBV。2. SVBV侵染性克隆的转化、接种和检测将重组质粒pBin-1.5SVBV电击转化农杆菌GV3101，筛选阳性克隆。农杆菌浸润法接种本氏烟（Nicotiana benthamiana）、三生烟（N. tabacum var. Samsun NN）、心叶烟（N. glutinosa）和森林草莓（Fragaria vesca）；另外，利用基因枪法将重组质粒pBin-1.5SVBV转入森林草莓和本氏烟。浸润接种及基因枪轰击20天后观察，4种植物均没有表现出任何特异性症状。提取各植物新长出的系统叶片基因组DNA，PCR检测SVBV基因特异性片段，发现能够在本氏烟、三生烟和心叶烟上系统叶中检测出SVBV，而利用基因枪轰击的草莓和本氏烟新生长的系统叶中检测不到SVBV。3. SVBV ORF Ⅵ基因编码P6蛋白的表达和纯化及抗血清制备PCR扩增SVBV ORF Ⅵ基因，插入原核表达载体pET-SUMO获得重组质粒pET-SUMO-ORF Ⅵ。转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导与Ni2+-NTA亲和柱纯化，获得分子质量约为90kD的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清，间接ELISA测定抗血清效价达1∶256000。Western-blot分析表明，该抗血清能够检测到稀释64000倍的重组蛋白。进一步的间接ELISA试验表明，制备的抗血清在较高的稀释度下（1∶512000），可以检测到SVBV中国分离物及美国分离物ORF Ⅵ基因在本氏烟中的瞬时表达。