目的：骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有多向分化潜能,是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后干细胞移植治疗的理想供体。MSCs移植能够改善AMI后心功能,但心梗后局部恶劣的微环境不利于移植细胞的存活,严重影响了其疗效。既往的研究表明他汀类药物能够抑制体外缺氧/无血清(hypoxia/serum deprivation, H/SD)及体内缺血导致的MSCs凋亡,提高干细胞移植疗效,但具体机制不清。自噬是细胞“自我吞噬”的复杂过程,可能在他汀对细胞存活和凋亡的调节中起到了重要的作用,但自噬是否参与H/SD条件下他汀对MSCs凋亡的保护尚未明确。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)途径是调控细胞能量代谢的关键信号通路,可以通过间接抑制它主要的下游效应分子,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的活化而激活白噬。因此本实验旨在通过H/SD模拟体内缺氧缺血环境,探讨白噬在H/SD诱导的MSCs凋亡中的作用；并假设临床上最常用的他汀类药物,阿托伐他汀(atrovastatin, ATV)能够通过AMPK/mTOR通路激活自噬而发挥其对MSCs凋亡的保护作用。方法：分离并培养Sprague-Dawley大鼠MSCs,将第三代细胞随机分为正常组(normal)、对照组(H/SD)、不同浓度梯度阿托伐他汀组(ATV0.001μM-10μM)、自噬抑制剂3-methyladenine组(3-MA,5mM)、自噬促进剂雷帕霉素组(rapamycin,10nM)、AMPK通路抑制剂Compound C组(10μM)。流式细胞仪检测MSCs自噬及凋亡比例；蛋白免疫印迹法(Western bolt, WB)检测自噬相关蛋白LC3、beclinl水平,凋亡相关蛋白bax、bcl-2、细胞色素C水平及AMPK、mTOR,总蛋白及其磷酸化的水平,透射电镜观察自噬体的形成,荧光显微镜观察AVO阳性细胞。结果：H/SD条件下ATV可以升高自噬细胞比例、增加LC3-Ⅱ的表达并促进自噬体的形成。自噬抑制剂3-MA在抵消ATV自噬促进作用的同时也增加了ATV组MSCs的凋亡率和促凋亡蛋白bax和细胞色素C的表达。与H/SD对照组相比,ATV各组AMPK的磷酸化水平显著升高而mTOR磷酸化水平显著下降。与ATV组相比,AMPK抑制剂Compound C组的AMPK磷酸化水平下降,mTOR磷酸化水平升高,并且MSCs自噬水平显著被抑制。结论：ATV可以抑制H/SD诱导的大鼠MSCs凋亡,这种保护机制主要与AMPK/mTOR通路介导的自噬激活有关。目的：骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)被广泛用于心肌再生医学研究。已有的证据表明急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后移植MSCs可以改善心功能,但由于AMI后缺血缺氧等恶劣的微环境导致大部分移植MSCs死亡而使其疗效受限。他汀类药物具有抗炎、抗氧化等多效性,能够提高移植疗效,但具体机制不清。因此,本实验在体外建立H9C2心肌细胞系缺氧/无血清(hypoxia/serum deprivation, H/SD)模型,并通过性别错配法在心梗大鼠体内移植异体骨髓MSCs,观察阿托伐他汀(atorvastatin, ATV)对移植MSCs存活及疗效的影响,并进行相关信号通路的分析和机制探讨。方法：体外实验分为浓度梯度实验与机制探讨两部分。其中浓度梯度部分设为正常组(normal组)、缺氧/无血清对照组(H/SD组)、阿托伐他汀各浓度组(ATV0.001μM、ATV0.01μM、ATV0.1μM、ATV1μM、ATV10μM)共7组；机制探讨部分设为normal组、H/SD组、最适ATV浓度组、焦磷酸牦牛儿基牦牛儿酯组(geranyl geranyl pyrophosphate, GGPP10μM)、ATV+GGPP组共5组。分别以Western Blot及ELISA方法检测相关因子及信号通路的水平变化。体内试验将140只雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠(6-8周龄)随机分为7组(每组20只)：假手术组(Sham)、AMI对照组(AMI)、单纯阿托伐他汀组(ATV),单纯MSCs移植组(MSCs),联合ATV+MSCs移植组(ATV+MSCs),联合ROCK抑制剂法舒地尔组(Fasudil), Fasudil+MSCs移植组(Fasudil+MSCs)。通过开胸结扎冠状动脉左前降支模拟AMI,30分钟后给予心肌内注射MSCs60μL(5×106细胞)。术后一周检测基线心功能。术后4周为实验终点,检测心功能,移植MSCs存活,分析相关信号通路蛋白。结果：体外实验表明,与H/SD组相比,ATV组白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)的表达和分泌均显著降低；而与ATV组相比,ATV+GGPP组IL-6、TNF-α及CTGF的表达和分泌显著升高(P<0.001)。相关信号通路研究发现尽管各组Rho激酶(Rho associated coiled-coil forming protein kinase, ROCK)、肌球蛋白磷酸酶靶标亚基(myosin phosphatase target subunit, MYPT)和胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)的总蛋白水平无明显变化(P>0.05),但ATV组的MYPT、ERK磷酸化水平较H/SD组明显降低(P<0.001),且GGPP可以抵消ATV的这种作用(P<0.05)。动物实验表明,MSCs移植后4周,与AMI对照组相比,心脏超声显示的左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter, LVEDd)、左室收缩末期内径(left ventricular end systotic diameter, LVESd)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)以及左心导管检测左室舒张末期压力(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP)、等容收缩期左心室内压力上升的最大速率(dp/dt)和等容舒张期左心室压力下降的最大速率(-dp/dt)等在MSCs组均无显著差异(P均>0.05),而LVEDd、 LVESd、LVEDP和-dp/dt在其余各组均显著减小(P<0.001),LVEF、LVFS和dp/dt仅在ATV+MSCs组和Fasudil+MSCs组显著升高(P<0.001)。组织化学分析显示,与AMI对照组相比,其余各组均可见炎症细胞浸润减少,梗死周边血管增多,但仅ATV+MSCs组和Fasudil+MSCs组的左室纤维化面积减小和存活心肌比例增多具有显著差异。荧光原位杂交和RT-PCR显示ATV+MSCs组和Fasudil+MSCs组的MSCs存活率明显高于MSCs组。Western Blot分析显示,阿托伐他汀抑制心肌IL-6、TNF-α及CTGF的表达,降低MYPT和ERK的磷酸化水平(<0.001)。结论：ATV可以促进移植MSCs的存活,改善MSCs移植治疗AMI的疗效,并且ATV的这种保护作用可能与其抑制RhoA/ROCK/ERK信号通路抑制了AMI后心肌炎症和纤维化有关。
