醛糖还原酶(Aldose Reductase, AR)为NADPH依赖性醛-酮还原酶家族成员之一,是多元醇代谢通路中的限速酶,可催化己糖或戊糖的NADPH依赖性还原反应,使之变成相应的糖醇或多元醇。本课题组前期发现并通过实验鉴定,AR作为转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)相关反应性基因之一,并在其诱导的肾小球硬化、肾脏纤维化中起着重要作用。近年来,随着对AR研究的逐渐深入,学者们开始认识到,AR在体内的最适底物并非葡萄糖,而是细胞内的一些有毒醛类化合物,例如4-hydroxy-trans-2-nonenal (HNE), AR对于这类底物的结合能力远高于糖类化合物。该类醛化合物最主要的来源为脂质过氧化,特别是ROS介导的脂质过氧化过程。有研究显示,TGF-β1致纤维化的作用机制中与ROS和氧化应激关系密切,ROS可以激活大量加剧组织损伤的信号通路,Nrf2就是其中之一,它的活化可以反过来加速ROS的生成以及ECM的沉积,提示ROS和Nrf2可能参与了TGF-β1上调AR的表达。Nrf2作为一个转录因子,其本身是否受到ROS通路的调节,是否在TGF-β1上调AR的表达中也具有桥梁作用,目前未见国内外报道。本课题从研究HMC表达AR与TGF-β1的相关性研究作为切入点,首次阐明了ROS和Nrf2在其中的作用及其分子机制。采用电子自旋共振(electron spin resonance,ESR)技术、Real-time PCR、Western Blot、报告基因等实验方法,证明了TGF-β1可以诱导HMC表达AR的增加；ROS和Nrf2参与了TGF-β1上调AR的表达。揭示了作为TGF-β1的相关反应性基因,AR的表达受其调控,分别体现在核酸、蛋白水平和活性上。进一步的信号通路研究表明,TGF-β1引起细胞内ROS水平增高,进而激活Nrf2信号通路,从而导致AR的转录水平以及翻译水平上调。对AR基因的启动子研究更加证明了转录因子Nrf2在TGF-β1诱导的AR上调过程中起着重要作用。目的探索ROS-Nrf2信号通路介导TGF-β1诱导HMC高表达AR过程的机制。方法HMC体外培养；Western blot、real-time RT-PCR、荧光法检测TGF-β1因子诱导HMC中AR高表达；ESR技术检测TGF-β1作用HMC后ROS量的变化；瞬时转染Nrf2siRNA和加入抗氧化剂NAC和SOD,对AR高表达的影响；加入外源性H202对Nrf2表达的影响：双荧光素酶报告系统检测Nrf2对含有ARE结合位点AR启动子转录活性的影响。结果1. TGF-β1可以诱导HMC表达AR的增加；随着TGF-β1作用时间的延长和剂量的增大,AR的基因表达水平发生变化,在24h内表达上调明显；AR蛋白表达增高和AR活性水平增强,与作用时间和剂量呈正相关。2. TGF-β1可以诱导HMC产生ROS的增加；随着TGF-β1作用时间的延长和剂量的增大,ROS数量发生变化,在30min内达到最多,与TGF-β1剂量呈正相关；3. TGF-β1可以诱导HMC表达Nrf2的增加,随着TGF-β1作用剂量的增大,Nrf2的蛋白表达水平逐渐增高,与TGF-β1作用剂量呈正相关；加入外源性ROS刺激HMC,Nrf2的蛋白表达水平增高。4.抗氧化剂SOD、NAC能够抑制TGF-β1诱导ROS的生成增多,进而抑制TGF-β1诱导AR基因水平、蛋白表达水平的增高和AR活性的增强。5.抗氧化剂SOD、NAC和Nrf2 siRNA都可以有效干扰Nrf2的表达,下调Nrf2表达能够抑制’TGF-β1诱导的AR基因水平、蛋白表达水平的增高和AR活性的增强。6.双荧光素酶报告基因证实,与转染pGL3-basic的对照组相比,HA-Nrf2可以使AR启动子区含有ARE结合位点的1.06k-AR-luc、ARE质粒转录活性显著增加；突变ARE序列的两个位点(ARE1、ARE2)后,可以显著降低ARE质粒的转录活性。结论1.作为TGF-β1的相关反应性基因,AR的表达受其调控,分别体现在核酸、蛋白水平和活性上。2.进一步的信号通路研究表明,TGF-β1引起细胞内ROS水平增高,并进而激活Nrf2信号通路,从而导致AR的转录水平、翻译水平上调以及酶活性增强。3.对AR基因的启动子研究更加证明了转录因子Nrf2在TGF-β1诱导的AR上调过程中起着重要作用。
