猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染引起的以仔猪严重腹泻、脱水、呕吐为主要临床特征的高度接触性传染病。该病最早于1946年在美国确认,目前已在多个国家广泛流行,给养猪业造成了严重的经济损失。早期的报道显示,TGEV作为一种肠道冠状病毒,能够诱导高水平的I型干扰素的产生,同时也引起肠道组织的炎性损伤,钠、钾离子严重失衡,进而导致仔猪严重腹泻脱水致死。这提示我们该病毒与宿主天然免疫应答密切相关,炎症反应在其致病性方面扮演着十分重要的角色。然而,目前对该病毒如何介导天然免疫应答引起宿主细胞的信号转导机制知之甚少。因此,本研究利用蛋白质组学技术分析了TGEV与宿主细胞蛋白之间的互作,并且对TGEV感染诱导炎症反应的细胞信号转导机制进行了研究。具体研究内容如下:1.TGEV感染PK-15细胞的蛋白质组学研究为了了解TGEV感染对宿主细胞蛋白表达的影响,利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,i TRAQ)技术,配合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS),对TGEV感染PK-15细胞的蛋白表达情况进行了检测和分析。共鉴定出162个差异表达的蛋白,包括60个表达上调的蛋白和102个表达下调的蛋白。随后利用生物信息学技术对差异表达蛋白的亚细胞定位、生物学进程聚类进行了分析,并绘制了互作网络图,发现差异表达的蛋白与细胞周期、细胞的生长与分化及天然免疫反应等多种生物进程相关。并且上调倍数位居前列的9个蛋白均与I型干扰素信号通路(interferon signaling pathway),尤其是信号转导子和转录激活子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)以及8种重要的干扰素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)密切相关。为了验证蛋白质组学结果的可靠性,进一步通过Western blot或Real-time RT-PCR方法对STAT1和8个ISG的表达进行了检测,结果与蛋白质组学结果一致。为了确定TGEV感染是否激活JAK-STAT1信号通路,对TGEV感染后STAT1的磷酸化情况和亚细胞定位进行了检测,结果 TGEV感染PK-15细胞后能够诱导STAT1的磷酸化和转位入核,说明TGEV感染能激活JAK-STAT1信号通路并诱导ISGs的产生。2.TGEV感染激活NF-κB信号通路的分子机制NF-κB是调控促细胞炎症因子、趋化因子产生的核心转录因子,在细胞的炎症反应中扮演着十分重要的角色,本研究对TGEV感染激活NF-κB的信号转导机制开展了研究。首先,利用NF-κB荧光素酶报告系统检测TGEV感染对NF-κB的激活情况,发现其能显著增强NF-κB启动子活性,且与病毒的复制密切相关。进一步发现TGEV感染能够诱导IκBα的降解,以及促进p65发生磷酸化和核转移。为了确定NF-κB在TGEV诱导炎症反应中的作用,我们使用NF-κB特异性活性抑制剂BAY11-7082处理细胞,结果抑制NF-κB活性后显著下调TGEV诱导的IL-6、IL-8、TNF-α、RANTES的表达,但不影响TGEV的复制。为了确定可能参与介导TGEV激活NF-κB信号通路的模式识别受体与接头蛋白,利用RNA干扰技术分别沉默受体蛋白基因RIG-I、MDA5和接头蛋白基因MAVS、STING的表达,结果这几个基因的沉默均能显著抑制TGEV诱导的p65磷酸化和多种促炎症细胞因子的表达,说明RLRs介导的信号通路参与TGEV激活NF-κB。3.TGEV感染激活JNK信号通路诱导炎症反应MAPK信号通路参与介导细胞生长、发育、分化、凋亡等多种生理病理进程,是机体重要的信号转导系统。MAPK能被多种炎性刺激激活,又对炎症反应的发生进行调控。因此,对TGEV感染影响MAPK通路进行研究有助于进一步全面了解TGEV诱导炎症反应的分子机制。首先,我们对TGEV感染是否激活MAPK通路进行了研究,结果显示,TGEV在感染后不同时间点能够诱导ERK1/2、JNK1/2、p38MAPK三种激酶发生磷酸化,并且双荧光素酶实验显示TGEV能够激活下游转录因子AP-1。为了进一步确定哪一条通路参与TGEV诱导促炎症因子的产生,分别使用ERK、JNK、p38 MAPK的特异性抑制剂对细胞进行了处理,结果显示当JNK1/2的激活受到抑制时能够显著降低TGEV诱导的IL-6、IL-8、TNF-α、RANTES的产生,且具有一定的剂量依赖性,这表明TGEV通过激活JNK1/2进而启动多种炎症因子的转录。有研究表明MAPK通路的激活对于多种病毒的复制是必需的,本研究对抑制剂处理后的TGEV增殖滴度进行了测定,结果抑制JNK1/2的激活能够显著降低病毒的滴度,这说明TGEV的复制依赖于JNK1/2的激活。
