软骨分化过程中的microRNA的功能研究

骨质性关节炎是人群中高发的骨骼疾病,其表现为关节软骨的降解和结构的破坏。关节软骨与胚胎发育过程中的软骨细胞是同一来源的,都是由间质祖细胞聚集分化而来。随着microRNA在脊椎动物发育中的作用被发现与报道,在软骨化过程中的相关microRNA研究成为了骨骼发育与骨关节炎病理研究的新一热点。近年来,已有关于软骨分化过程中的相关microRNA研究报道,但对软骨分化和关节炎病理发生中特异性调控的microRNA了解仍然并不充分。本文旨在通过对软骨分化过程的microRNA差异化芯片分析寻找该过程中特异调控的功能性microRNA,并探究其在软骨发育中的调控机制与功能。本文实验通过体外原代培养鼠E12.5肢芽细胞,对其软骨化过程与Wnt/β-catenin信号诱导的非软骨化过程进行差异化对比芯片分析,发现了miR-140、miR-140*、miR-455在软骨分化过程中特异表达;miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-206肌肉相关的microRNA在Wnt/β-catenin信号诱导作用下高量表达。随后,通过RT-PCR、RACE、原位杂交等实验,本文发现miR-140,miR-140*的初始转录本通过内含子保留形式特异在软骨发生过程中表达,并与其宿主基因Wwp2-C共表达。Wwp2-C基因在软骨中的特异性表达以及蛋白编码能力在本文中首次被报道与验证。为了探求miR-140/140*表达的特异性,本文通过对克隆的miR-140/140*初始转录本的启动子区域进行荧光素酶激活实验以及与软骨特异性转录因子Sox9的ChIP实验,发现Sox9通过与-200bp碱基位点的直接结合激活了miR-140在软骨发生中特异表达。接着,本文进一步在软骨发生中探究miR-140的功能,利用RCAS::miR-140-Sponge病毒在鸡胚肢芽细胞中特异性抑制miR-140在软骨发生中的功能,发现miR-140对于维持软骨发生过程中的细胞增殖过程是必须的。结合生物信息学预测以及分子生物学验证,本文发现细胞周期调控基因Sp1是miR-140在软骨发生过程中的一个靶基因。综上所述,本文通过对软骨发生过程与Wnt诱导的非软骨化过程的microRNA差异对比分析发现miR-140特异表达于软骨发生中,它与宿主基因Wwp2-C共表达并受到转录因子Sox9的直接诱导,在软骨发生中它通过对细胞周期调控蛋白Sp1的直接靶向作用维持软骨细胞增殖。以上研究拓展了软骨发生过程中的microRNA功能研究,为microRNA在骨骼发育过程中的作用提供了新的机制,同时为骨关节炎治疗的作用靶点提供了新的基础研究。