肝细胞生长因子对慢性肾衰竭肾脏保护作用的研究

慢性肾衰竭（CRF）是严重影响人类健康的疾病，它是以肾小球硬化、肾间质纤维化的不断进展为特点，末期的治疗是血液净化及肾移植，给社会及家庭带来严重的负担。因此如何减慢CRF进展，减慢其发展至终末期肾衰竭的进程有重大的社会及经济效益。5/6肾切除后的残余肾是研究慢性肾衰竭病理生理过程的常用且经典的实验动物模型。5/6肾切除后，有效肾单位减少，形成剩余肾小球高灌注、高滤过及高压力，最终导致肾小球硬化，肾小管萎缩、肾间质纤维化，比较符合人类慢性肾衰竭的病理改变。在CRF进展过程中有很多机制参与其发病，其中系膜细胞的过度增生及系膜基质的增多被认为是导致肾小球硬化及肾间质纤维化的重要机制之一。系膜细胞增生是肾小球损伤的反映，活化的系膜细胞是系膜基质的主要来源。系膜细胞的增生和细胞外基质的积聚在慢性肾脏疾病的进展中起关键作用，抑制系膜细胞的增生将有利于延缓慢性肾脏疾病的进程，因此进一步开发能够抑制系膜细胞增生的药物至关重要。转化生长因子-β1（TGF-β1）是刺激系膜细胞增生的重要炎症因子，也是重要的致纤维化因子，可加速慢性肾衰竭的进展。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）是平滑肌细胞和肌成纤维细胞的特征性蛋白，在肾小管上皮细胞中α-SMA表达的增多被认为是小管上皮细胞肌纤维母细胞转分化的标志。而目前研究认为α-SMA诱导的系膜细胞活化是基质沉积、肾小球硬化性损伤的重要环节。肝细胞生长因子（HGF）最初是从部分肝切除大鼠血浆中分离出来的，随后从其他组织中相继提取出来。HGF是一种多效性的多肽细胞因子，具有促发有丝分裂、细胞移动、抗凋亡等多种生物学活性。同时，HGF还可以调节纤维化性疾病的发生和发展，已证实有抑制肝纤维化的作用。目前有很多研究认为其对肾纤维化同样有抑制作用。为了寻求更好的防治慢性肾衰竭进展的方案，我们拟探讨HGF基因治疗是否对减慢CRF进程有潜在价值，并进一步探讨其机制。目的：研究HGF基因治疗对防治慢性肾衰竭进展的作用并探讨其相关作用机制。方法：1.体外研究：（1）应用体外细胞培养技术培养大鼠肾小球系膜细胞（RGMCs），脂多糖（LPS）作为RGMCs增生刺激物，采用MTT方法检测肝细胞生长因子重组质粒（PCI-neo-HGF）对RGMCs增生的影响。（2）应用RT-PCR技术检测PCI-neo-HGF对α-SMA、TGF-β1mRNA表达的影响，用Western blot技术检测PCI-neo-HGF对α-SMA、TGF-β1蛋白表达的影响。2.慢性肾衰竭（5/6肾切除）模型的构建：第一次手术采用2%戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉大鼠，选取背左侧切口，暴露左肾，剥离肾包膜，将左肾的上下极各1/3切除，无菌线结扎止血。第一次手术后7天，行第二次手术，同样方法麻醉，右侧背部切开暴露右肾，结扎肾蒂，摘除右肾。3.体内研究：用5/6肾切除大鼠作为研究模型，将大鼠随机分8组，即空白对照组（n=12, Ctrl）、空质粒组（n=12, PCI-n）、假手术组（n=12, Sham）、模型对照组（5/6肾切除组，n=12, Model）、洛汀新组（n=12, Loten）、小剂量HGF质粒治疗组（n=12, Low）、大剂量HGF质粒治疗组（n=12, High）、洛汀新与大剂量HGF质粒合用组（n=12, Lo+H）。Low、High及Lo+H组均分别于第二次肾切除后的第2、3、4周对每只大鼠左后肢内侧肌肉多点注射PCI-neo-HGF(0.5ml)质粒，剂量分别为每次230μg、460μg、460μg（质粒预先与氢氧化铝凝胶混合）。PCI-n组以同样方法，在同样时间每只每次注射空质粒PCI-neo300μg。Ctrl、Sham、Model及Loten组在同样时间给予同等剂量氢氧化铝凝胶于相同部位进行肌肉注射。Loten及Lo+H组的洛汀新按0.6mg/100g/day的剂量与20毫升水混合以水溶饮饲方法给药，其余6组予以等量水于同样的时间饮饲，从第二次术后第一天开始给予，连续5周。分别于第二次手术后5周及9周处死动物，收集24小时尿液、血液；留取肾组织标本进行光镜HE染色、免疫组化以及分子生物学检查；RT-PCR检测α-SMA、TGF-β1mRNA表达，Westem blot及免疫组化检测α-SMA、TGF-β1蛋白表达。结果：1. HGF对正常RGMCs的增生无抑制作用，可抑制LPS刺激的RGMCs的增生。同时证明HGF对正常RGMCs的α-SMA、TGF-β1的表达无影响，而对LPS刺激的RGMCs的α-SMA、TGF-β1mRNA及蛋白的表达有明显的抑制作用，且随剂量增加及时间的延长抑制作用增强。2.本研究构建了5/6肾切除大鼠模型，通过对肾功能及肾脏病理的检测，显示了5/6肾切除大鼠模型是研究慢性肾衰竭的理想模型。3.体内研究发现PCI-neo-HGF、洛汀新均有肾脏保护作用，PCI-neo-HGF随剂量增加保护作用增强，PCI-neo-HGF与洛汀新两者合用作用叠加，对肾功能的保护作用、降低尿蛋白及对肾小管间质保护作用最好。PCI-neo-HGF、洛汀新均有抑制α-SMA、TGF-β1mRNA及蛋白表达的作用，且两种物质合用对α-SMA及TGF-β1的抑制作用更强，与生化指标及病理改变一致。结论：本研究采用PCI-neo-HGF基因治疗慢性肾衰竭，证实HGF可保护肾功能，降低尿蛋白及减轻肾小管间质的损伤，其机制与抑制肾小球系膜细胞及肾小管间质α-SMA、TGF-β1mRNA及蛋白的表达有关。