水稻耐低钾资源的筛选及钾离子转运关键基因的初步鉴定

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钾是水稻生长发育不可缺少的营养元素之一。而我国耕地土壤普遍缺钾,以土壤含速效钾少于70μg/g计共达2.3×107hm2,占总耕地面积22.7%。其中南方水稻主产区缺钾已成为一个制约高产、优质的普遍问题。中国钾肥供应不足是一个不争的事实,如果依赖每年用大量外汇进口钾肥既不能解决我国耕地缺钾之困也绝非长久之计。因此筛选出耐低钾的水稻对于缓解我国的钾肥不足具有一定的意义。许多研究发现,不同基因型水稻之间的钾吸收利用效率显著不同,说明植物钾营养性状是受遗传控制的。因此从基因水平来研究钾离子的吸收转运机制是十分必要的。本研究以湖南省水稻所和湖南师范大学植物发育学实验室提供的392个不同年代主栽常规稻、108个来源于茶陵野生稻的杂交后代、54个水稻不育系和124个日本晴/9311的杂交后代为材料进行低钾比较,并对耐低钾和不耐低钾材料进行钾离子转运关键基因的比较分析,旨在促进水稻耐低钾育种,以提高我国粮食生产的稳产性和种粮效益。其主要研究结论如下:1)根据低钾营养(K浓度:3mg/L)和完全营养(K+浓度:40mg/L)培养至五叶期的植株相对干重以及植株缺钾症状,将水稻耐低钾能力分成1-4级,耐低钾能力最强为1级,从392个不同年代主栽常规稻中筛选出1级品种26个、108个来源于茶陵野生稻的杂交后代中筛选出1级材料5个、54个水稻不育系和124个日本晴/9311的杂交后代中没有1级品种。2)用钾离子转运关键基因设计的引物对耐低钾材料和不耐低钾材料进行PCR检测,OsTPK-A、C2和OsHKT4-eGFP在所有检测材料中均能检测到目的带。OsKAT3在部分材料中能检测到目的带,但该基因的有无与水稻表型之间未呈现相对应的关系。3)对2个耐低钾材料和2个不耐低钾材料进行钾离子转运关键基因表达差异比较发现OsTPK-A、C2、和OsHKT4-eGFP在4个基因型中均有表达,且3个基因在不同水稻基因型中的表达量均存在差异,这种差异与其耐低钾能力未表现出对应的关系。4)对耐低钾和不耐低钾材料中的OsTPK-A、C2和OsHKT4-eGFP的PCR产物进行测序。经序列比对发现粳稻OsTPK-A基因375位点是G,籼稻OsTPK-A基因375位点是T,不耐低钾的天龙香103和湘晚籼10号在58位点上C变成了T;不同水稻基因型的C2基因在内含子区域的某些位点上存在碱基差异,这种差异对基因的功能没有影响;不同水稻基因型的OsHKT4-eGFP基因在外显子区域和内含子区域的某些位点上均存在碱基差异,外显子区域的差异可能对基因的功能有影响。
摘要第3-5页
ABSTRACT第5-7页
1 文献综述第11-20页
    1.1 钾在农业生产上的地位第11页
    1.2 我国钾素资源的应用现状第11-12页
    1.3 钾素营养的生理意义第12页
    1.4 钾营养基因型差异的研究进展第12-14页
        1.4.1 不同植物种类之间的差异第12-13页
        1.4.2 同一种植物不同品种间的差异第13-14页
    1.5 植物吸收钾离子的分子基础及研究进展第14-18页
        1.5.1 低亲和性K吸收系统(钾离子通道)第15-16页
        1.5.2 高亲和转运体第16-18页
        1.5.3 钾离子通道调控蛋白第18页
    1.6 研究目的与意义第18-20页
2 材料与方法第20-32页
    2.1 材料第20-27页
        2.1.1 筛选材料第20-23页
        2.1.2 试剂与营养液的配制第23-25页
            2.1.2.1 低钾营养液与完全营养液的配制第23-24页
            2.1.2.2 水稻基因组DNA提取试剂第24页
            2.1.2.3 水稻RNA提取试剂第24-25页
            2.1.2.4 PCR相关试剂和试剂盒第25页
        2.1.3 钾离子转运关键基因第25-26页
        2.1.4 钾离子转运关键基因的鉴定、表达和测序第26页
        2.1.5 主要实验仪器第26-27页
    2.2 方法第27-31页
        2.2.1 水稻苗的培养第27页
        2.2.2 耐低钾能力的鉴定标准第27页
        2.2.3 水稻总DNA的提取第27-28页
        2.2.4 PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳第28-30页
        2.2.5 水稻总RNA的提取第30页
        2.2.6 RNA的反转录第30-31页
        2.2.7 半定量RT-PCR扩增及基因序列比对第31页
    2.3 数据统计与分析第31-32页
3 结果与分析第32-43页
    3.1 水稻耐低钾基因型的筛选第32-39页
        3.1.1 不同年代主栽常规稻耐低钾基因型的筛选第33-37页
        3.1.2 来源于茶陵野生稻的杂交后代耐低钾基因型的筛选第37-39页
        3.1.3 水稻不育系耐低钾基因型的筛选第39页
        3.1.4 日本晴和9311杂交后代耐低钾基因型的筛选第39页
    3.2 钾离子转运关键基因的检测、表达和序列比对分析第39-43页
        3.2.1 钾离子转运关键基因的检测第39-40页
        3.2.2 钾离子转运关键基因的表达分析第40-41页
        3.2.3 钾离子转运关键基因的序列比对分析第41-43页
4 讨论第43-46页
    4.1 水稻耐低钾资源及应用第43-44页
    4.2 水稻耐低钾的分子机制第44-46页
参考文献第46-50页
附录第50-75页
致谢第75-76页
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