研究背景内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一种来源于骨髓的原始细胞,与人类胚胎时期的成血管细胞(angioblast)和人脐带静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)相似,在一定的条件下可诱导分化成为成熟的内皮细胞。它不仅仅参与胚胎时期的血管生成,而且出生后,在微血管新生、损伤血管内皮修复和功能维持中仍然有重要的作用。近年来,血管相关性疾病发病率逐年上升。在各种致病因素的作用下,血管内皮层的完整性受到破坏,各种物质在血管壁沉积、炎性细胞浸润、血管壁硬化和脆化、血管腔狭窄是其最基本的病理改变。目前的药物治疗和介入治疗均不能完全恢复血管的解剖结构,心血管病还是会随着时间的推移而复发。体内外试验证实,EPCs可以增殖分化为成熟的EPCs,形成管腔样结构,因此EPCs治疗逐渐被应用于血管相关性疾病的治疗,被认为是血管相关性疾病最有前景的治疗措施之—1977年,Asahara等首次报导了从人的外周血中分离出EPCs,从此开始了真正意义上的EPCs的研究时代。随后,Murohara等又在脐带血中发现了CD34+的细胞,在体外诱导可以分化为成熟的EPCs,认为脐带血中也存在EPCs。随着实验技术的不断发展,人们相继在胎儿肝脏、骨髓、动脉血管外膜和脂肪组织中分离出EPCs。实验证实,EPCs不仅在胎儿时对血管生成有重要的作用,对出生后微血管新生和血管内皮维护同样有重要的意义。近年来干细胞技术的出现与成熟,为合并心功能不全的心肌缺血性心脏疾病治疗带来了突破性进展,其中用粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)动员自体骨髓干细胞治疗取得了显著成就。G-CSF是一种多肽细胞生长因子,亦是刺激骨髓细胞集落形成的集落刺激因子的一种,可由斑块内的巨噬细胞、平滑肌细胞(smooth muscular cells, SMCs)、内皮细胞(endothelial cells, ECs)分泌。G-CSF是首个被发现的骨髓造血干细胞强有力的动员剂,已证明具有动员EPCs的作用,同时也能动员间充质干细胞及内皮前体细胞。研究证实,G-CSF在体内、体外均可促进内皮前体细胞的增殖,并能动员内皮前体细胞特异性地向缺血心肌迁移,增加缺血组织的血管新生,单个核细胞分化为内皮细胞的数量增加,EPCs克隆形成亦增多,具有改善组织血流的治疗作用,从而有效促进心功能的恢复,逆转心肌梗死大鼠左室重构,改善预后。因此可以认为G-CSF骨髓干细胞动员既可以促进心肌细胞再生也可以促进梗死区血管再生,从而使心梗后心功能得到改善。与骨髓干细胞移植相比,干细胞动员疗法不需要干细胞的提取、制备,不需要介入手术,该疗法简便易行,便于临床应用。心肌梗死(myocardial infarction, MI)是冠状动脉急性闭塞导致部分心肌缺血性坏死的过程。MI的外科手术、介入治疗等传统治疗手段主要是重建血供,并不能完全修复损伤和再生心肌细胞。近年来,EPCs成为了治疗缺血性心血管疾病的研究热点。EPCs不仅参与人胚胎血管生成,也参与出生后血管新生(angiogenesis)和内皮损伤后的修复过程。随着对EPCs生物学特性的认识及其在急性心肌梗死治疗中研究的不断深入,应用“动员剂”将EPCs从骨髓中动员到外周血中,参与坏死心肌的修复及血管新生,为防治心肌细胞凋亡、心室重构的急性心梗患者提供了新的思路。其具体机制是,当心肌梗死发生时,有少数EPCs受炎性趋化因子的作用被“招募”到心肌缺血部位,参与心肌和血管的再生,但这种作用很微小,不能足以恢复受损伤的心肌,也就不能阻止左室重构的发生及心力衰竭的进展。近几年干细胞动员剂应用于心肌梗死的治疗得到广泛关注。应用动员剂将EPCs从骨髓中动员到外周血中,从而使外周EPCs达到治疗所需的数量,利用其自动归巢(Homing)到梗死区并在心肌微环境下分化的特性,参与坏死心肌的修复及血管新生。在多个已完成的EPCs治疗急性心肌梗死的多样本动物试验中,发现心功能可得到一定程度的改善。心脏的收缩与舒张均为耗能过程,心肌能量学(myocardial energetic, ME)系研究心肌能量、代谢、需氧与供氧平衡和心脏作功关系的一门学科。研究心肌能量代谢状况并进行有效的调节,改善心肌能量代谢水平是治疗缺血性心脏病及抑制心衰进展的有效方法。研究心肌能量代谢状况并进行有效的调节,提高OFR的清除能力,改善心肌能量代谢(myocardial energy expenditure, MEE)水平,纠正血流动力学紊乱是治疗缺血性心脏病及抑制心衰进展的有效方法。EPCs为心梗合并心功能不全的治疗开启了一条崭新的途径,但目前多停留在动物试验阶段,临床研究仍不多,本研究选取心肌梗死后心力衰竭的患者,在标准治疗的基础上应用G-CSF动员EPCs,观察其对炎性因子、抗氧化酶、心肌能量代谢等变化的影响,探讨EPCs改善心功能的可能途径,以期为临床应用提供可靠的依据。一、研究对象和方法1.病例选择：入选标准①年龄75岁以下；②既往有明确的心肌梗死病史至少1个月以上；③逐渐出现心力衰竭临床表现,心功能NYHA分级II-IV级；④彩色多普勒超声心动图证实左心室扩大,室壁节段运动异常,静息状态下左室射血分数(LVEF)<45%。排除标准：心源性休克；严重心律失常；心源性晕厥病史；肝、肾功能不全；有恶性肿瘤及血液系统病史的患者。2.病例与分组对解放军第303医院2008年10月至2010年10月收治的心肌梗死患者进行随访,自满足入选标准起的近4个月内因心衰发作入院的共38例患者纳入研究,男性24例,女性14例,年龄46-75岁,平均(60.89±7.53)岁。25例患有高血压,20例有糖尿病史,21例有高脂血症,16例患者有吸烟嗜好；梗死时间3个月-2年,平均(11±8.46)个月。前间壁梗死9例、前壁梗死10例、广泛前壁梗死10例、下壁梗死6例、后壁梗死3例；术前NYHA心功能分级Ⅲ/Ⅲ/Ⅳ级分别为10/24/4例。在常规治疗的基础上随机分为治疗组和对照组：每组19例。两组患者基本情况均衡,在年龄、性别、合并症、梗死时间部位及治疗用药情况相似,具有可比性。另选19名健康志愿者作为健康组。3.治疗方法治疗组在常规治疗的基础上给予粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(商品名：吉粒芬,杭州九源生物基因工程有限公司生产,规格150μg/支)450μg/d皮下注射,连续注射5 d。对照组予以注射同等剂量生理盐水。所有患者在治疗及随访期间根据临床需要给予相应的药物治疗,包括利尿药、硝酸酯类、抗血小板药物、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)、β受体阻断药、他汀类调脂药物及降血压、降血糖等对症处理。4.外周血血管内皮祖细胞的测定方法两组患者分别于治疗前、治疗后第7天、第14天、第28天、第4个月,清晨空腹抽取外周静脉血8ml,采用密度梯度离心法从受试者外周静脉血中分离单个核细胞,用内皮细胞基础培养基EBM2培养至第7d,分析贴壁细胞。向贴壁细胞中加入乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL,2.4 mg/L),在37℃下孵育1h后,用体积分数为2%多聚甲醛固定细胞10 mmin,固定后用PBS液洗涤2次,再加入豆凝血素Ⅰ(FITC-UEA-I)和乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)在37℃下孵育1h。上述步骤完成后于倒置荧光显微镜下观察,摄取豆凝血素Ⅰ(FITC-UEA-I)和乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)即双染色阳性(黄色荧光)细胞被认为是正在分化的EPCs,红色荧光的为acLDL阳性细胞,绿色荧光的为UEA-I阳性细胞。将EPCs培养于6孔板中,孵育2d时收集未贴壁细胞(包括EPCs),调整密度为1×106细胞／孔,置入24孔板中,继续培养5d,计数每个样本中每孔的克隆数。5.左室射血分数(LVEF)检测应用GE Logig 7彩色多普勒超声诊断仪,分别于治疗前、治疗后第2周和第4个月行常规超声心动图检测,测左室长轴切面、左室短轴切面、心尖四腔切面,测量左室结构指标：左室射血分数(LVEF)。6.血浆脑钠肽(BNP)浓度测定两组患者分别于治疗前、治疗后第7天、第14天、第28天、第4个月,清晨平卧、空腹、采肘静脉血5m1,用100 g/L乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,并加入抑肽酶,离心后分离血浆,采用双抗夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定血浆脑钠肽浓度(仪器为美国ABBOTT检测仪器1。7.心功能临床疗效评定标准：按NYHA心功能分级标准,心力衰竭纠正或心功能改善二级以上为显效；心功能改善一级为有效；心功能无改善或恶化者为无效。8.心肌能量代谢检测应用GE Logig 7彩色多普勒超声诊断仪,分别于治疗前、治疗后第2周和第4个月行常规超声心动图检测,测左室长轴切面、左室短轴切面、心尖四腔切面,测量左室结构指标如下：短轴缩短率(FS)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期容积(EDV)、收缩末期左室后壁厚度(PWTs)、每搏输出量(SV)、射血时间(ET),各项指标取3个连续心动周期的平均值。在超声检查结束时,记录患者的身高、体重,用袖带血压计测定收缩压。按相关参考公式计算：左心室收缩末圆周室壁应力(circumferential end-systolic wall stress, cESS)代表左室收缩末张力的量度标准：；MEE(无创方法评估心肌生物能量消耗)：MEE(cal/systole)=cESS(kdyn/cm2)×ET(s)×SV(ml)×4.2×10-4。9.炎性因子的测定两组患者均于治疗前及治疗后第7天、28天清晨安静平卧状态下空腹肘静脉采血,采用酶联免疫吸附法检测血浆高敏C-反应蛋白水平(C-reactive protein, CRP)水平,采用放射免疫分析法检测血中白细胞介素-6(interleukin-6, IL-61和肿瘤坏死因子-α(necrotic factor-α, TNF-α)的水平。高敏C-反应蛋白水平检测试剂盒由晶美生物制品有限公司提供,白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α检测试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供。均按试剂盒说明书进行操作。10.抗氧化酶的测定两组患者均于治疗前及治疗后第7天、28天清晨安静平卧状态下空腹肘静脉采血,肝素抗凝,3000r/min离心5min后留取血浆,-80℃保存待测。红细胞即刻用0.9%氯化钠溶液冲洗3次后,进行SOD抽提,留取含有SOD的上清液,-80℃保存。SOD试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,按照试剂盒操作步骤进行。用日本产200-20型紫外分光光度计检测MDA水平,药盒由南京生物工程研究所提供。11.统计学方法统计学处理所有资料均采用SPSS13.0统计软件进行处理。计量资料用均数±标准差表示。同组间两均数前后比较采用两独立样本配对t检验,不同组间两均数比较采用两独立样本t检验,检测水平为双侧,相关性方法采用Pearson相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。二、研究结果1.安全性38例心肌梗死患者治疗过程均安全,随访未发现无严重并发症。本研究发现EPCs治疗心梗合并心衰患者最常发生的不良反应为发热,未出现不良的心血管事件,如恶性心律失常、心衰恶化及再发心肌梗死等。治疗组100%患者的血白细胞水平均出现不同程度的升高,予对症处理1-4周逐渐恢复至用药前水平。2.治疗前后外周血EPCs数量的变化两组心肌梗死合并心功能不全患者的外周血EPCs水平均大于健康志愿者的平均水平(P<0.01)；两组患者治疗后EPCs水平均大于治疗前；两组患者相同治疗时间点比较,治疗组EPCs水平均高于对照组,各组比较有统计学差异(P<0.05)；治疗组EPCs水平于第7天达到峰值,增高较对照组及同组其他治疗时间点比较有显著性差异(P<0.01)；随观察时间的延长,EPCs水平呈递减趋势,但治疗组EPCs水平至第4个月仍高于治疗前(P<0.05)；对照组EPCs水平治疗后第3天、第7天较治疗前有统计学意义(P<0.05),治疗后第14天、第28天、第4个月较治疗前无统计学意义(P>0.05)。3.治疗前后血浆脑利钠肽(BNP)水平变化两组患者血浆脑利钠钛水平各时间点均高于健康志愿者的平均水平15.8±8.7ng/L；两组治疗后血浆BNP水平各时间点均下降,对比治疗前具有显著性差异(P<0.01)；治疗组第7天、第14天、第28天的血浆BNP水平与对照组比较有统计学差异(P<0.05)；两组治疗后第7天、第14天、第28天、第4个月进行组内比较,各时间点无统计学意义(P>0.05)。4.治疗前后左室射血分数(LVEF)变化趋势两组患者治疗第4个月的LVEF水平与治疗前相比较,增加有统计学意义(P<0.05)；治疗组与对照组治疗后第2周、第4个月LVEF均呈增加趋势,但两组间比较无显著性差异(P>0.05)。5.心功能疗效的比较对照组19例患者中显效1例,有效14例,无效4例,总有效率78.9%；治疗组显效2例,有效15例,无效2例,总有效率89.4%。两组间总有效率比较无统计学差异(P>0.05)。6.超声心动图检查结果治疗前后LVIDs变化趋势：两组患者治疗后各时间点的LVIDs水平与治疗前相比较,降低有统计学意义(P<0.05)；治疗组LVIDs水平治疗后第2周和第4个月与对照组比较,降低有统计学(P<0.05)；治疗前后EDV变化趋势：两组患者治疗EDV水平与治疗前相比较有所降低,但无统计学意义(P>0.05)；治疗前后SBP变化趋势：两组患者治疗后各时间点的SBP水平与治疗前相比较,均无统计学意义(P>0.05)；治疗组治疗后第2周和第4个月与对照组比较,降低也无统计学(P>0.05)；治疗前后PWTs变化趋势：两组患者治疗后各时间点的PWTs水平与治疗前相比较,降低无统计学意义(P>0.05)；治疗组PWTs水平治疗后第2周和第4个月与对照组比较,降低无统计学(P>0.05)；治疗前后ET变化趋势：两组患者治疗后各时间点的ET水平与治疗前相比较,减少有统计学意义(P<0.05)；治疗组ET水平治疗后第4个月与对照组比较,减少有统计学意义(P<0.05)；治疗前后SV变化趋势：两组患者治疗后各时间点的SV水平第4个月与治疗前相比较,增多有统计学意义(P<0.05)；治疗组SV水平治疗后与对照组比较,增多无统计学意义(P>0.05)；治疗前后FS变化趋势：两组患者治疗后第4个月的FS水平与治疗前相比较,增加有统计学意义(P<0.05)；治疗组治疗后第2周与对照组比较,增加无统计学意义(P>0.05)；治疗组FS水平治疗后第4个月与对照组比较,增加有显著性差异(P<0.01)。7.心肌能量消耗检测结果治疗前后cESS变化趋势：两组患者治疗后各时间点的cESS水平与治疗前相比较,降低有统计学意义(P<0.05),治疗组治疗后第2周与对照组比较,降低无显著性差异(P>0.05),治疗组cESS水平治疗后第4个月与对照组比较,降低有统计学意义(P<0.05)；治疗前后MEE变化趋势：两组患者治疗后各时间点的MEE水平与治疗前相比较,降低有统计学意义(P<0.05)；治疗组治疗后第2周与对照组比较,降低无显著性差异(P>0.05)；治疗组MEE水平治疗后第4个月与对照组比较,降低有统计学意义(P<0.05)。8.炎性因子检测结果心肌梗死合并心衰患者血清CRP、TNF-α、IL-6升高较健康志愿者有统计学意义(P<0.05)。与治疗前相比,两组治疗后血清CRP. TNF-α、IL-6有所降低,有统计学意义(P<0.05),其中治疗组第7天CRP较对照组下降有显著性差异(P<0.01)。9.抗氧化酶酶测定结果两组患者治疗后心肌组织中SOD活性提高,LPO. MDA的生成减少(P<0.05),治疗组变化优于对照组,有统计学意义(P<0.05)。三、结论：1.EPCs动员剂G-CSF治疗MI合并心功能不全患者安全有效；可以明显增加患者EPCs数量、提高EPCs功能；同时可部分提高左室射血分数,降低血浆BNP水平,增加心输出量,射血时间具有缩短趋势,心脏收缩功能得到部分改善；对心肌能量代谢具有明显改善作用、降低心肌生物能量消耗。2.EPCs动员剂G-CSF治疗心梗后心衰患者,可进一步降低CRP水平,抑制炎症反应,减轻心肌损害；同时可能进一步增强抗氧化酶活性,提高氧自由基清除能力。
