文昌鱼是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是现存的与脊椎动物祖先最接近的无脊椎动物,一直被作为研究生物进化和胚胎发育的典型材料。弗罗里达文昌鱼基因组的测序完成,为利用分子生物学手段,研究文昌鱼基因的结构、进化和表达,揭示文昌鱼发育的分子生物学机制奠定了坚实的基础。本论文对文昌鱼(Branchiostoma belcheri) IGF基因的克隆、表达、功能及其受GH作用上调表达展开了研究,从而提供了文昌鱼存在GH/IGF轴的证据。GH/IGF轴在所有的脊椎动物中都存在,但它的进化起源还不清楚。我们从头索动物文昌鱼中克隆并鉴定了一个编码IGF多肽的cDNA。我们克隆得到的cDNA全长为1630 bp,开放阅读框(ORF)为924 bp,5’非编码区长23 bp,3’非编码区长683 bp。ORF编码一个307个氨基酸的蛋白质,BbIGF,其理论分子量为35 kDa,在23-101位上具有IGF_insulin_like的保守结构域。BbIGF前101位包括了24位的信号肽,B链,C链和A链,具有胰岛素前体的结构特点;后面部分又可分为D链和E链,这又是胰岛素样生长因子的结构特点。在BbIGF的B链和A链中,我们找到了六个保守的用于形成链内和链间二硫键的半胱氨酸残基。Southern杂交表明BbIGF在青岛文昌鱼基因组中是单拷贝的,这与加利福尼亚文昌鱼的insulin/IGF基因为单一拷贝结果一致。Northern blot显示BbIGF只有一个转录产物,长度约为2100bp。切片原位杂交结果显示,文昌鱼的BbIGF基因在肝盲囊和后肠特异性表达。这也为免疫组织化学的结果所证实,BbIGF主要位于肝盲囊和后肠的细胞质中。BbIGF的表达模式为文昌鱼肝盲囊与脊椎动物肝脏同源的假说提供了论据。此外,免疫印迹实验表明BbIGF在文昌鱼体液中也存在,提示在消化系统中合成的多肽能够被分泌到血液中,经血液循环流遍整个身体。将阳性重组表达质粒pET32a/BbIGF转化大肠杆菌BL21感受态细胞后,用IPTG诱导表达,用镍离子亲和树脂进行纯化。运用MTT法检测FG-9307细胞的生长情况,结果表明体外表达的重组BbIGF蛋白具有促有丝分裂的功能,能促进牙鲆鳃细胞的增殖。但重组BbIGF不能降低血糖水平,提示它可能不具有胰岛素的功能。以上研究表明BbIGF在功能上与IGF更为相似。从文昌鱼中剥取肝盲囊,切碎(1 mm3),在加入了100 ng/ml和0 ng/ml(对照)的重组鼠GH的培养基中培养。实时定量PCR结果显示,外源重组鼠GH对BbIGF在文昌鱼肝盲囊中的表达有显著的促进作用。此外,GHR是一种存在于脊椎动物肝脏里的整合膜蛋白,RIPA是适用于提取膜蛋白的缓冲液。通过Western blotting技术发现文昌鱼肝盲囊存在一个类似鼠GHR的膜蛋白分子。这些研究结果都表明在文昌鱼中GH和IGF存在密切的联系,由此将GH/IGF轴进化的源头向前推进到了原始的脊索动物,也为进一步研究原索动物的GH/IGF轴铺平了道路。
