猪2型链球菌间接ELISA和间接血凝抗体检测方法的建立及应用

猪链球菌(Streptococcus suis，S．suis)能引起猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎和败血症等，该菌有35个血清型，其中2型流行最广、且致病性最强，并能感染人，是一种重要的人畜共患病病原。但猪链球菌经常与其他一些病原如猪放线杆菌、猪丹毒杆菌和猪蓝耳病病毒等发生混合感染，给临床诊断和抗体水平的检测造成了很大困难。因此，本课题的研究目的：1建立以猪2型链球菌荚膜多糖为抗原的间接ELISA检测方法。2构建溶血素基因的原核表达质粒，并分析表达产物的免疫反应性，建立以溶血素为靶蛋白的猪链球菌间接血凝(IHA)抗体检测方法。3以上述两种方法对临床上送检血清进行检测，验证建立的两方法的符合率，并分析最近一年内我国猪2型链球菌的流行病学特点。猪2型链球菌能产生多种毒力因子，常见的有荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein，MRP)、胞外因子(Extracellular factor，EF)，溶血素(Suilysin，SLY)等，其中CPS是最早被证实的猪2型链球菌毒力因子，也是进行分型的依据，本试验用改良的kodana方法提取猪2型链球菌的荚膜多糖，并以此作为抗原建立间接ELISA抗体检测方法，对各方面条件进行优化，研制出猪2型链球菌间接ELISA抗体检测试剂盒。另外发病猪的猪2型链球菌中有相当高比例的菌株表现出溶血素活性，因而猪2型链球菌溶血素被认为是该菌主要的毒力因子。本研究根据猪2型链球菌溶血素基因序列设计一对特异性引物，采用PCR扩增猪2型链球菌LT-1分离株溶血素基因，将扩增产物克隆到pMD18-T质粒载体中，酶切和PCR鉴定后测序鉴定。结果显示，扩增的LT-1株溶血素基因长度为1494bp，编码497个氨基酸。将溶血素基因克隆入表达载体pET-28a中，提取重组质粒进行PCR和酶切鉴定，筛选阳性克隆，用SDS-PAGE电泳和Western blot进行溶血素的表达和鉴定。结果表明表达产物具有免疫反应性。然后以表达的溶血素蛋白为抗原致敏绵羊红细胞，并对各方面条件优化，建立猪链球菌间接血凝试验(IHA)。用间接ELISA方法检测从河南、安徽、江西、湖南、湖北、福建、广东、广西和北京等地送检的血清样品共3991份，结果表明阳性率分别为33.75％，41.6％等，各省血清样品阳性率从0％到41.6％。本研究建立的两种检测方法操作简单、特异性强、敏感性高并适用于猪链球菌的抗体检测和流行病学调查。