二十世纪九十年代,双光子共聚焦激光扫描荧光显微镜的出现引发了一场活体内高分辨显微成像的技术革命。与传统的单光子共聚焦激光扫描荧光显微成像技术相比,双光子共聚焦激光扫描荧光显微成像技术具有近红外长波长激发、暗场成像、光漂白程度和光毒性低、靶向激发、高横和纵向分辨率等显著的优势。迄今为止,双光子共聚焦激光扫描荧光显微成像技术是活体分子成像领域中时间和空间分辨率最高的技术,它的出现和发展极大地促进了生命科学各个领域的发展。然而,常用荧光探针的双光子激发效率很低,大大制约了双光子共聚焦激光扫描荧光显微成像技术在活体成像领域的应用,因此设计制备高效的、标记特异性的双光子荧光探针是当今生物成像中的急需解决的难题。本文首先对双光子吸收、单光子吸收过程与双光子吸收过程的区别、双光子性能与其分子结构关系等方面进行理论概述,阐述了双光子荧光显微成像技术的独特优势,并从被测目标物的角度详细归纳了现有双光子荧光探针及其在生物成像方面的应用。其次,设计合成了七个基于芴为母体的D-π-A结构的双光子荧光染料,其中TPFL-Lyso和TPFL-ER为亚细胞器标记探针。本文以9,9-二甲基-2-硝基芴为原料,经硝基还原、氨基取代、付克酰基化和Click反应,得到目标染料,同时对目标染料进行基本性质表征及生物成像方面的测试。以TPFL系列探针为例,该类探针具有显著的溶剂生色效应；TPFL-Lyso探针最大活性双光子吸收截面为232GM (750nm, DMSO)其在水中的溶解度为3.6μM,并对pH的敏感性较低；同时该系列探针具有较低的细胞毒性。生物荧光显微成像试验证明：TPFL系列探针具有良好的细胞通透性,TPFL-Lyso、 TPFL-ER分别对溶酶体、内质网具有高校的特异性标记,同时在小鼠肝部组织具有良好的探测深度(约220μm)。最后,利用亲核取代反应和Sonogashira偶联反应合成了四个基于芘衍生物的双光子荧光染料。该四种染料在不同溶剂中的的吸收光谱和发射光谱均表现出一定的溶剂生色效应,采用双光子荧光诱导的方法测得s-TPPy0、s-TPPy2和TPPy的最大活性双光子吸收截面分别为43GM (THF,800nm)、36GM (EtOH,810nm)和936GM (THF,740nm)。染料s-TPPy0, s-TPPy2和TPPy具有良好的细胞通透性和双光子成像效果。
