疫苗接种对我国新城疫病毒进化的影响及新城疫LaSota疫苗株全长cDNA克隆

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新城疫是由新城疫病毒引起的一种烈性病毒性传染病,是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一,也是我国所有鸡病中危害最大的一种,被国际兽疫局列为A类传染病。该病发病急、致死率高,对养禽业的发展构成严重的威胁。在我国主要广泛接种新城疫疫苗来控制该病的感染,由于减毒活疫苗使用相对方便,因此它常被用于群体免疫。我国NDV免疫密度和次数也远远超过世界水平。由于大面积的疫苗使用,新城疫得到了较好的控制,但近些年来,NDV出现了一些新的疫情,在免疫过的鸡群中即使能产生高的抗体滴度,新城疫仍时有爆发。而且大量使用的疫苗株难免流失到环境中,目前那些散落在环境中的疫苗毒株对新城疫病毒本身造成的影响并没有完全了解。为了确定在我国广泛应用的新城疫疫苗是否对该病毒进化进程产生影响,在本研究中,我们对在我国流行的新城疫病毒进行了系统发生和重组分析,获得了一系列NDV间疫苗参与的同源重组的证据,表明疫苗可能通过同源重组影响我国新城疫病毒的进程。由于疫苗与流行株之间的重组可能导致出现疫苗接种失败的后果,因此,在临床上应当尽可能避免疫苗与野生株之间的重组。故在NDV防治过程中,应该采用合适的免疫程序避免这种重组的发生。由于负链RNA病毒重组率很低的观点被广泛接受,因此尚没有人系统研究过NDV之间是否存在重组现象。当然,这个问题在NDV疫苗使用过程中也一直被忽略,至今没有任何有关NDV疫苗参与病毒进化方面的报道。NDV间重组的机制完全未知。通过评估病毒重组在NDV生物学性状,特别是疫苗重组后对病毒毒力变化中的影响,了解重组对NDV遗传多样性方面究竟有多大作用,以确定NDV是否能够开发为一种安全的疫苗载体。因此有必要建立NDV同源重组的实验系统,为NDV疫苗株和流行株的重组提供实验室证据。反向遗传系统的建立是研究NDV同源重组的前提,因此,本研究拟以广泛用来预防新城疫的一种弱毒疫苗的NDV LaSota株为材料,构建NDV反向遗传系统。首先我们对其进行了纯化和扩增。然后针对NDV LaSota株设计了十二对引物,然后采用RT-PCR对全基因组进行分段扩增,最终获得了涵盖全基因组的十二个cDNA片段,再将它们克隆入pMD18-T载体中并进行测序。通过生物信息学软件(DNAman)分析LaSota的核苷酸序列,找出各种限制性内切酶位点的分布,然后按照一定的先后顺序,将不同的限制性内切酶位点酶切、连接、转化,最终构建出NDV LaSota株基因组全长cDNA克隆pMC18-LaSota,本研究为NDVLaSota株与流行株之间重组的研究奠定了基础。
中文摘要第7-9页
Abstract第9-10页
第一章 前言第13-22页
    1. 新城疫及新城疫病毒概述第13-14页
    2. 新城疫病毒分子生物学研究进展第14-16页
        2. 1 新城疫病毒基因组的结构特点第14页
        2. 2 新城疫病毒编码蛋白的研究进展第14-16页
    3. 新城疫病毒疫苗研究进展第16-20页
    4. 新城疫病毒反向遗传系统研究进展第20-22页
第二章 疫苗接种对我国新城疫病毒进化的影响第22-28页
    1. 材料和方法第22-23页
    2. 结果第23-26页
    3 .分析与讨论第26-28页
第三章 新城疫病毒 LASOTA 疫苗株全基因组克隆和序列分析第28-44页
    1 材料第29-33页
        1. 1 新城疫病毒疫苗株、鸡胚、菌株、质粒第29页
        1. 2 主要仪器第29-30页
        1. 3 药品及试剂盒第30页
        1. 4 溶液配方第30-33页
    2. 方法第33-42页
        2. 1 SPF 鸡胚培养病毒第33-34页
        2. 2 病毒的分离鉴定:血凝抑制实验和血凝实验第34-35页
        2. 3 引物设计第35-36页
        2. 4 病毒总 RNA 的提取及 RT-PCR第36-38页
        2. 5 PCR 产物的电泳及目的条带的回收第38-39页
        2. 6 感受态细胞的制备与保存第39页
        2. 7 目的片段与 pMD18-T 载体的连接及转化第39-40页
        2. 8 菌落 PCR 及阳性质粒的提取第40-42页
        2. 9 pMD18-T-Ln 质粒测序及序列比对第42页
    3. 结果第42-43页
    4. 讨论与分析第43-44页
第四章 新城疫病毒 LASOTA 疫苗株全长 CDNA 的构建第44-62页
    1. 材料第44-45页
        1. 1 菌株、质粒第44页
        1. 2 主要仪器(见第二部分)第44页
        1. 3 药品及试剂盒第44-45页
    2. 方法第45-48页
        2. 1 目的片段在 pMD18-T 上的方向第45页
        2. 2 所用的酶切位点是否发生突变第45-46页
        2. 3 具体的质粒酶切连接方案第46-47页
        2. 4 酶切连接的实验步骤第47-48页
    3. 结果第48-59页
        3. 1 重组质粒 T-L1-2 的鉴定第48页
        3. 2 重组质粒 T-L1-3 的鉴定第48-49页
        3. 3 重组质粒 pMC18-L1-3 的鉴定第49-50页
        3. 4 重组质粒 pMC18-L1-4 的鉴定第50-51页
        3. 5 重组质粒 pMC18-L11 的鉴定第51-52页
        3. 6 重组质粒 pMC18-L10-11 的鉴定第52页
        3. 7 重组质粒 pMC18-L10-12 的鉴定第52-53页
        3. 8 重组质粒 pMC18-L10-12-HDT 的鉴定第53-54页
        3. 9 重组质粒 T-L8-9 的鉴定第54页
        3. 10 重组质粒 T-L7-9 的鉴定第54-55页
        3. 11 重组质粒 pMC18-L6-9 的鉴定第55-56页
        3. 12 重组质粒 pMC18-L6-12-HDT 的鉴定第56-57页
        3. 13 重组质粒 pMC18-L5-12-HDT 的鉴定第57-58页
        3. 14 重组质粒 pMC18-LaSota 的鉴定第58-59页
    4. 分析和讨论第59-62页
第五章 结论第62-63页
第六章 附录第63-78页
    附录6-1:质粒图谱第63-64页
    附录6-2:论文中的相关表格第64-70页
    附录6-3:论文中的测序结果第70-78页
参考文献第78-83页
致谢第83-84页
攻读硕士学位期间发表文章第84页
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