人CD34+造血干/祖细胞和日本血吸虫的转录组学和蛋白质组学研究

本论文在杨芃原教授和韩泽广研究员的指导下进行，主要工作在国家人类基因组南方研究中心完成。本博士论文的主要贡献为：1．对人CD34+造血干／祖细胞进行了转录组和蛋白质组学研究，鉴定了370个蛋白质，这是迄今为止鉴定最多的CD34+细胞蛋白，并且鉴定了各种转录组研究没能发现的133个CD34+细胞蛋白，发现了CD34+细胞具有可塑性的新的证据，证明了反义核酸未能完全阻止其相应基因的表达，并提出一些蛋白的异质性是由于翻译后修饰造成；2．对日本血吸虫进行了大规模转录组学和蛋白质组学研究，得到了大量的重要发现。获得了约15000个基因种类，约占日本血吸虫基因总数的90％，其中包括8400多个血吸虫基因编码蛋白质，建立了目前世界上最大的日本血吸虫功能基因组公共数据库、基因克隆库和菌种库；鉴定了3260个不同生活周期的以及表皮的血吸虫蛋白，并首次鉴定了卵壳蛋白，提供了众多药物靶点和潜在疫苗的选择；在血吸虫基因中发现了大量的遗传多态性位点，并用序列测定和蛋白质组数据验证；分析得到了血吸虫保守的和特异的蛋白，为认识血吸虫生物学特征、开发抗血吸虫药物以及研制血吸虫疫苗奠定了理论基础；3．鉴定并分析了纯化后的日本血吸虫样品中的63个宿主蛋白，并用免疫组化验证。这是首次发现如此多的宿主蛋白可能与血吸虫密切相互作用。这些宿主蛋白与宿主在血吸虫感染时的免疫反应、成虫的免疫逃避和肉芽肿的形成有关，从而丰富了宿主-寄生虫的相互作用方面的信息。本论文工作包括三个部分：1．蛋白质组学技术平台的建立与完善，为后续研究工作奠定了基础；2．人CD34+造血干／祖细胞转录组和蛋白质组学研究，3．日本血吸虫转录组／蛋白质组学研究。其中造血干细胞研究和日本血吸虫研究是两个独立的研究课题。第一部分蛋白质组学技术平台的建立与完善优化了双向电泳-MALDI质谱分析有关的方法，包括蛋白质样品的前处理方法的选择和优化，双向电泳、胶内酶解的方法和优化，MALDI-MS分析，以及数据库建立和手工解谱等；另外，建立并改善了色谱分离、质谱分析的技术体系、以及相应的大规模数据分析的技术策略。这些工作，搭建和完善了本单位的蛋白质组学研究平台，为本论文后续CD34+细胞和日本血吸虫的大规模蛋白质组学研究奠定了良好的实验基础。第二部分人CD34+造血干／祖细胞转录组／蛋白质组学研究CD34+造血干细胞可以自我更新和分化成为血液细胞，近来有报道认为这些细胞还可以分化成为非血液细胞。CD34+细胞是研究最多的干细胞，最近也有人应用蛋白质组学方法对这些细胞进行了研究，但是结合转录组学和蛋白质组学方法，系统地研究CD34+细胞还未见报道。我们收集了脐带血CD34+细胞，应用转录组学研究方法结合蛋白质组学研究手段，包括双向电泳、微量液相色谱等技术分离蛋白质、生物质谱仪蛋白质定量与定性测定，研究分析了CD34+细胞的蛋白质组。在CD34+细胞中鉴定了370个蛋白质，其中52个蛋白质与代谢、细胞骨架有关。蛋白质组数据还显示，CD34+细胞自我更新还需要其它与细胞分裂、染色质调控、RNA处理以及蛋白合成、蛋白折叠、蛋白修饰和蛋白降解有关的蛋白质。我们还鉴定出CD34+细胞中46个未知蛋白，证明了相关未知基因的表达。我们应用间接免疫荧光测定方法选择性地验证了四个代表性的蛋白质，包括膜蛋白、胞浆蛋白和核蛋白，结果证明了质谱鉴定所得到的数据的可靠性。本研究鉴定了各种成血细胞的代表性标志。这些数据进一步说明了脐带血CD34+细胞具有多能分化潜力，可以成为不同的成血细胞。我们还惊奇地发现，脐带血CD34+细胞内含有通常与神经发育、眼睛、性腺发育相关的蛋白质，这显然提示CD34+细胞具有某种程度的可塑性，也就是造血干细胞可能分化成为非血液细胞。这也正是近年来干细胞的研究热点之一，因为干细胞的可塑性意义重大，它为干细胞的临床应用带来的光明的前景。我们的数据还显示，CD34+细胞表达一些激素和细胞因子，这说明这些因子可能通过自分泌和旁分泌，影响CD34+造血干细胞的自我更新与分化。我们通过对CD34+细胞蛋白质组学分析，发现了以往多个转录组学研究所未能发现的133个蛋白质，并用RT-PCR验证了它们的转录本。本研究发现，有33个蛋白在2DE胶上有两个或两个以上的蛋白点。最多的是烯醇化酶，有20个蛋白点。我们分析了大量的转录组数据，在比较了基因的各种剪切变化和蛋白质组数据后，我们发现，这些蛋白在胶上的异质性的主要原因是翻译后修饰，而不转录水平上的剪切。在转录组中有128个基因的反义转录本以及相应的正义转录本序列，我们意外地发现，具有反义转录本的15个蛋白质出现在蛋白质组数据中，这个有趣的现象说明在反义转录本存在的条件下，正义转录本可以转录表达，而没有完全被反义转录本阻断。基因是否表达，可能取决于正义和反义转录本的相对比例。第三部分日本血吸虫转录组／蛋白质组学研究血吸虫病造成严重的公共健康问题。我们首次对日本血吸虫(Schistosoma japonicum)的转录组和蛋白质组进行了整合比较分析。在本研究中，我们获得了日本血吸虫84000个EST序列和15000个血吸虫基因，包括8420个潜在的蛋白编码基因，建立了世界上最大的日本血吸虫功能基因组数据库。我们发现，在8420蛋白中，有419和583个基因可能编码分泌蛋白和膜蛋白，而分泌蛋白是血吸虫释放到宿主体液内的蛋白来源，膜蛋白如果在表皮上，则有可能参与宿主-血吸虫的相互作用。与已知基因有相似性的血吸虫基因有5077个，功能分类显示各个虫期功能蛋白的分布比例接近。结合色谱或电泳与质谱手段，首次对日本血吸虫不同生活周期的蛋白表达谱进行了大规模的广泛分析，包括尾蚴、肝期童虫(整个虫体和表皮)、成虫(混合性别成虫，雌虫，雄虫以及它们的表皮)、卵(整个卵以及空的卵壳)和毛蚴。血吸虫样品的蛋白分离组份超过400个，采集的串联质谱图超过42万个。鉴定了26484个非冗余肽段，代表3260个不同的血吸虫蛋白，其中，在尾蚴、肝期童虫、成虫、卵和毛蚴中分别鉴定了～900-1400个蛋白，其中各个虫期特有的蛋白为～230-470个，这反映了不同生活周期的血吸虫适应不同的生活环境。将不同生活周期的EST和蛋白情况进行了比较。发现蛋白质组和转录组数据交盖程度比较高，最高的达到86.8％，而通常认为蛋白质组数据和转录组数据的重叠率只有30％。鉴定了373个血吸虫表皮蛋白，来自雌虫、雄虫、混合性别成虫和肝期童虫。除少数已知表皮蛋白外，大量的表皮蛋白都是新鉴定的。这些表皮蛋白的鉴定，为疫苗的研制和药物靶点的设计，提供了前所未有的选择余地。鉴定了520个血吸虫卵壳蛋白，第一次明确了卵壳的蛋白组成。发现卵壳含有与抵抗氧化压力、免疫、粘附有关的蛋白，以及参与钙流动通路和肉芽肿形成机制的蛋白。这为理解宿主-血吸虫的相互作用提供了重要的信息。血吸虫的基因里，鉴定了～7000个单核苷酸多态性位点，发现其中一些位点造成蛋白突变，或者产生加长或缩短的蛋白产物。我们还发现大量的血吸虫基因处于纯化选择压力之下，而少数基因则处于正选择压力下。基因组序列测序和质谱数据证实了一些基因的多态性位点。我们还在血吸虫基因中发现了大量的插入和缺失长度变化以及微卫星位点。血吸虫基因的这些多态性变化，可能与感染性的差异、中间宿主和终宿主内的发育、对药物的敏感性以及致病性和免疫原性有关。这些新的发现为解释血吸虫逃避、调节或削弱宿主免疫反应提供了证据。在比较了血吸虫蛋白和其它模式动物的蛋白序列后，得到了1336个进化上高度保守的日本血吸虫蛋白，有助于了解血吸虫的抗原模拟、免疫逃避和寄生虫的免疫依赖性生长。我们还分析了得到了1323个潜在的血吸虫特异蛋白，这为治疗血吸虫病的疫苗、药物、诊断试剂，提供了潜在的靶点。日本血吸虫成虫会吸附宿主蛋白包被其体表，以避免宿主的免疫攻击。我们分析了日本血吸虫样品中“污染”的宿主蛋白。本研究中，我们采用大规模的蛋白质组学技术分析了血吸虫样品“污染”的宿主蛋白。我们在血吸虫样品中发现63个宿主蛋白，其中有1、2、27和40个蛋白分别在尾蚴、童虫、成虫和卵中。这是首次发现如此多的宿主蛋白可能与血吸虫密切相互作用。这些宿主蛋白与宿主在血吸虫感染时的免疫反应、成虫的免疫逃避和肉芽肿的形成有关，从而丰富了宿主-寄生虫的相互作用方面的信息。