在哺乳动物中,体细胞克隆胚胎能够发育成个体的成功率一直很低。即使能够发育到妊娠后期,也往往出现胎儿巨大、胎盘异常等现象,从而影响克隆动物生产效率。多倍体细胞主要参与胎盘等胚外组织的形成,将多倍体胚胎与克隆胚胎聚合为一体进行移植,可以改善胎盘异常等引起的效率底下现象。因此,多倍体胚胎的研究对于进一步了解克隆动物发育机理具有重要意义。本研究采用免疫荧光染色、药物处理、孤雌激活、反向核移植等技术,研究了获得孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的技术途径、分析了卵母细胞核的存在对体细胞核重编程的影响,以便为进一步完善体细胞克隆技术提供实验依据。1、牛、山羊、绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞核和细胞骨架的动态学变化在牛、山羊、绵羊卵母细胞体外成熟过程中,收集成熟不同时间的细胞,通过对纺锤体微管、微丝和染色体的免疫荧光染色,分析了在整个体外成熟过程中细胞核的成熟进程以及细胞骨架和染色体的动态变化。结果显示：牛和山羊卵母细胞在成熟培养后的4h开始发生GVBD,12h即有50%-60%的卵母细胞到达MI期,16h到达AI/TI期峰值(42%),20h后牛和山羊分别有66%和84%的卵母细胞进入MII期；绵羊卵母细胞核成熟进程略慢于牛和山羊,GVBD发生的时间也是成熟培养后的4h,但达AI/TI期峰值的时间和发育为MII期的时间分别为20h(50%)和24h(76.5%),均晚于牛和山羊；卵母细胞在体外成熟过程中,其细胞骨架和染色体动态变化在三种动物基本相似,在部分绵羊卵母细胞出现三级纺锤体等异常结构。2、细胞松弛素B(CB)对牛卵母细胞减数分裂和二倍染色体卵母细胞形成的影响将牛卵母细胞置入含有CB的培养液中培养后,分别观察了CB的浓度和处理方法对卵母细胞发育的影响,其结果是：(1)培养时间24h(全程处理),CB浓度≥2.0μg/ml时,卵母细胞的成熟率≤44.8%,成熟卵母细胞的染色体单倍性组成比例≤73.9%,两者均显著低于对照组的83.1%和93.8%；处理组有50%以上的卵母细胞未排出第一极体(PB1),其中的50%-65%染色体为60条,呈二倍性；处理的卵母细胞中出现纺锤体形态异常、两个纺锤体、60条染色体组成超大纺锤体等现象。(2)在培养时间6-8h分别添加7.5μg/ml和15μg/ml的CB预处理,然后移到无CB的培养液中继续培养至24h,其结果卵母细胞的成熟率约为80%,与对照组的83%没有显著性差异,将预处理时间延长到10h使成熟率显著降低(60%)。(3)在未处理培养液中培养10h,然后转移至含有3.0-7.5μg/mL CB的培养液中继续培养到24h(后处理),结果只有41.5-7.2%的卵母细胞排出PB1,其余58.5-92.8%没有排除PB1。(4)在无CB的培养液中培养10h,然后移至含有7.5μg/ml CB的培养液中分别培养至24h、30h、36h、48h,进行免疫荧光染色,观察卵母细胞所处核相,结果是30h以上处理组AI/TI期卵的比例为1.9-6.4%,显著低于24h处理组的15.3%,而多数为由60条染色体组成的巨大纺锤体细胞。以上结果表明,CB可能破坏纺锤体结构,从而抑制PB1排出,降低卵母细胞成熟率,导致二倍染色体(2n或4c)卵母细胞的形成。3、细胞松弛素B(CB)对牛四倍体孤雌胚胎发育的影响将卵母细胞分为三个处理组：一是CB浓度为0.1-10.0μg/ml,培养时间24h的处理组(全程处理组)；二是在含有7.5和15μg/ml CB的培养液中预培养6-10h后移至不加CB的培养液培养至24h(预处理组)；三是用不加CB的培养液培养10h后转到含有CB的培养液中继续培养至24h(后处理组)。然后对三个处理组分别进行孤雌激活和发育培养,观察CB对四倍体孤雌胚胎发育的影响。结果是：(1)后处理组的四倍体孤雌胚囊胚发育率(25-28%)明显高于全处理组(5%-15%)、前处理组(7％-16%)和对照组(12%-16%)。(2)对后期处理组得到的孤雌胚胎进行染色体分析发现,来源于未排PB1的卵母细胞的胚胎中,有74%的1-细胞胚胎、82%的2-细胞胚胎和75%的囊胚是四倍体(4n=120)。(3)对激活后40h未卵裂的卵母细胞进行染色体分析发现,有15%以上含有超多倍数染色体,这说明在40h内发生了多次DNA复制。以上结果表明,通过CB处理形成的二倍染色体(2n或4c)牛卵母细胞,能够发育为四倍体胚胎,且发育率很高。4、卵母细胞核的存在对克隆胚胎供体核重编程和多倍体胚胎发育的影响以未去核的MII期卵母细胞为胞质受体构建重构胚胎,检测了卵母细胞核的存在对供体细胞核重编程的影响,包括对早熟染色体凝集(premature chromosome condensation, PCC)、染色体结构和重构胚发育的影响,在此基础上探索了以未去核卵母细胞构建的重构细胞能够发育为多倍体的可能性。研究结果显示：(1)受体细胞MII纺锤体的存在更容易诱发重构细胞中的供体细胞发生PCC。(2)供体细胞核与受体细胞MII纺锤体之间的位置关系对第二极体(PB2)的排出有影响,当两者的纺锤体距离比较远时,94.4%的重构细胞能够排出PB2；当两者的纺锤体位置接近时,几乎所有重构细胞都没有排出PB2,大部分(67.9%)形成超大纺锤体,受体卵母细胞和供体细胞的染色体混为一体。(3)用去核卵母细胞构建的重构胚胎被激活后,其卵母细胞和供体核显示出多种原核形态,并且发育不同步。(4)上述重构胚经过发育培养后,以卵丘细胞为核供体时卵裂率和囊胚发育率分别为81.9%和22.3％,与对照组的84.9%和29.1％没有显著差异(p>0.05)；以成纤维细胞为核供体时卵裂率和囊胚发育率分别为90.3%和22.7%,与对照组的81.9%和31.1%也没有显著差异(p>0.05)；而囊胚孵化率则以卵丘细胞为供体时0,以成纤维细胞为供体时27.5%,分别低于对照组的23.1％(p<0.05)和72.3％(p<0.05)。(5)以未去核卵母细胞为受体的重构囊胚其细胞山各种多倍体细胞混合而成,包括2n/4n、2n/6n、2n/8n和2n/4n/8n；并且这种来源的囊胚细胞数(约60个细胞)明显少于去核对照组的囊胚细胞数(约90个细胞)。(6)通过反向核移植(reverse nuclear transfer, RNT)的方法研究结果显示：重构胚融合后1h去核组的囊胚发育率为47.2%,显著高于3h去核组的20%,(p<0.01)；重构胚融合3h后去核,使染色体构象出现异常。以上结果表明,卵母细胞的MII纺锤体能够诱发供体细胞发生PCC；以去核卵母细胞为受体构建的重构胚能够发育为囊胚期克隆胚,但其发育能力明显低于以去核卵母细胞为受体的重构胚,并且所有囊胚都是混合多倍体。
