内分泌干扰物对鸡胚性腺发育的影响及其机理的研究

近50年来，随着工业、农业的飞速发展，大量的化学合成物质伴随现代化的生产流程及其副产物被释放到了环境中。其中有一些结构类似动物和人体内激素，能干扰体内天然激素正常的合成、分泌、利用、作用和代谢，这些化学物质被称为内分泌干扰物（EDCs）。近年来，有关外源性化合物对动物和人内分泌系统的干扰进行了广泛的研究。已经证实EDCs对动物雌激素、甲状腺素、儿茶酚胺、睾酮等呈现显著的干扰效应，而临床上以生殖障碍、出生缺陷、发育异常、代谢紊乱以及某些癌症为特征。本实验选用鸡胚作为实验动物，采用体内外实验来研究激素和多氯联苯（PCBs）及己烯雌酚（DES）对鸡胚性腺发育和生殖细胞增殖分化的影响。 体外实验：建立了鸡胚卵巢生殖细胞-体细胞体外无血清共培养模型，刚分离的卵巢细胞悬液中主要包含生殖细胞（主要是卵原细胞和部分初级卵母细胞）和体细胞（颗粒细胞、类固醇生成细胞和上皮细胞等），生殖细胞的直径大于体细胞。培养24h后，细胞基本上贴壁，其中体细胞贴在培养板底部，呈梭状生长，到培养48h基本铺满整个板底，生殖细胞呈圆形或椭圆形紧贴生长于其上，它们的直径大约在15～25μm。生殖细胞c-kit染色呈阳性。在此共培养体系中，增殖细胞核抗原（PCNA）染色显示生殖细胞具有较高的增殖活性并且细胞在无血清的培养体系中可存活10天以上。 首先验证该培养模型对激素的反应性，用卵泡刺激素（FSH） （0.25～1.0IU／ml）和17β-雌二醇（E2）(10-8～10-5M)单独或联合处理细胞，培养48h后，观察细胞数目变化并用PCNA免疫细胞化学显示增殖细胞，计算生殖细胞的PCNA标记率（LI）。FSH（0.25～1IU／ml）及E2(10-7～10-5M)处理组生殖细胞数目显著增多（P＜0.01），与对照组相比，FSH和E2处理后细胞轮廓清晰，立体感更强。PCNA免疫细胞化学显示，FSH及E2(10-7～10-5M)处理后，生殖细胞细胞核着色较深，阳性率显著高于对照组（P＜0.05）。此外，FSH和E2还表现出协同作用。上述结果证实该模型对激素作用敏感，可用于评价外源性激素、药物、毒物对生殖细胞及体细胞作用的研究。 利用此培养模型来评价PCBs对卵巢细胞体外增殖的影响，培养同时用浙江人学硕卜论文Aroclor 1254（0.1一10 pg/ml）处理细胞。结果发现，低浓度PCBs（0 .1一l“g/m1）主要表现出雌激素样作用，促进了生殖细胞的增殖，而高浓度PC8s (10 09/m”则对生殖细胞和体细胞产生强烈的毒性作用，处理几个小时内即可导致细胞核染色质固缩，细胞脱落崩解成碎片。处理6h后四甲基偶氮哇盐（MTT）法测定细胞的活性和乳酸脱氢酶（LDH）释放水平检测显示PCBs （10 pg/m1）导致卵巢细胞活性明显降低（P<0.05）和LDH释放量显著升高 （P<O.05），进一步证实了形态学观察的结果。pCBs对细胞的毒性作用可被抗氧化剂VE所缓解。24h后，PCBs的雌激素样作用开始呈现出来，幸存下来的生殖细胞开始增殖分化。用他莫西酚可阻断尸CBs的雌激素样作用并引起更强烈的毒性作用。以上结果表明，尸CBS可干扰卵巢生殖细胞的增殖并可通过其毒性作用和雌激素样作用干扰鸡胚性腺发育。 体内实验:将PCBS（AroClorz254，100 pg/枚）、DES（100 pg/枚）、EZ（100协g/枚）、克罗米酚（100协g/枚）等注射到10日龄艾维因鸡胚气室内，然后用石蜡封口，放置38℃、湿度为60%白勺恒温箱中继续孵化至19日龄，取鸡胚性腺及输精（卵）管，进行组织学分析。结果发现PCBs、DES明显促进卵巢皮质的发育（P<0 .05），效果类似E:;PCBs对皋丸发育呈现微弱的雌激素样作用，生精细胞分化受到抑制，细精管管壁显著变薄（p<。.01），而雌激素DES、E，作用于攀丸会导致翠丸萎缩，甚至雌性化翠丸横截面积比对照组显著减少，细精管管壁也变薄（P<0.05）。尸CBs以上雌激素样作用能被克罗米酚阻断。此外，与EZ相比，PCBs、OES对雌性和雄性生殖细胞表现出强烈的毒性作用，使大多数生殖细胞发生核固缩和胞质空泡化，细胞间隙增大，雄性的精细管结构也受到破坏。以上结果表明DES更多呈现出雌性激素样作用，而 PCBs对鸡胚性腺呈现出毒性和雌性激素的双重作用。 结论:体外实验结果表明FSH和EZ对18日龄鸡胚卵巢生殖细胞具有促进增殖作用，PcBs则对卵巢细胞具有毒性和雌性激素的双重作用。体外实验的结果得到体内实验的进一步验证。因此，鸡胚卵巢生殖细胞一体细胞体外共培养模型可用作评价激素和EDCs对雌性生殖系统发育的影响及探讨其作用机制的研究。