1、人TNFR1-PLAD及其突变体基因克隆与表达纯化及其生物学活性鉴定 2、小鼠TNF-α及其突变体基因克隆与表达鉴定

TNFR1论文 PLAD论文 TNFR封闭肽论文 TNF结合肽论文 pIRES2-GFP-wtTNF
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TNFR1胞外段含有四个半胱氨酸富集区(CDR)区,在与TNF-α结合前首先通过CDR1区形成三聚体,所以CDR1区又称为PLAD(pre-ligand assemblydomain)。本课题组前期研究采用噬菌体展示技术分别用sTNF-α和TNFR1为诱饵筛选到12AA的“TNF结合肽”和“TNFR封闭肽”,体内、体外实验均证实两种肽都对TNF-α介导的生物学效应有较好的抑制作用。但由于短肽自身半衰期较短,极易通过肾小球滤过,无法充分发挥应有的药效。因此,本实验利用分子克隆技术及蛋白纯化技术获得PLAD三聚体化所需的关键肽段,试图将该片段分别连接到“TNF结合肽”和/或“TNFR封闭肽”末端,使之通过TNFR1-PLAD的自身三聚化作用而聚合为三聚体,延长两种肽在体内的的半衰期,为进一步研发抗TNF-α药物奠定基础。随着人们生活水平日益提高,肥胖也变得越来越普遍,全球范围内超重的人群数量多于体重不足的人群数量。随着肥胖的流行,肥胖相关的一些疾病的发病率如代谢综合征、非酒精性脂肪肝和II型糖尿病等也不断增加,而胰岛素抵抗是这些疾病发病机制中的一个关键环节,但其细胞水平的机制尚不完全清楚。肿瘤坏死因子-(TNF-α)作为脂肪组织分泌的脂肪细胞因子,它参与调节食欲、胰岛素敏感性以及炎症反应等各种生理和病理过程。TNF-α又分跨膜型(tmTNF-α)和分泌型(sTNF-α),tmTNF-α、sTNF-α都可以与TNFR相互作用,但引起的生物学功能并不相同。我们实验室前期工作表明:tmTNF-α可杀伤对sTNF-α耐受的肿瘤细胞株,sTNF-α主要诱导细胞坏死,而tmTNF-α则主要诱导凋亡,因此推测tmTNF-α在胰岛素抵抗中可能发挥的作用与sTNF-α也不相同。本文成功构建表达野生型TNF-α-(即可表达sTNF-α,也可表达tmTNF-α)的TNFpIRES2-GFP-wtTNF质粒、只表达tmTNF-α的pIRES2-GFP-tmTNF-α的质粒和只表达sTNF-α的pIRES2-GFP-sTNF-α质粒,并将其稳定转染3T3-L1前脂肪细胞,以便进一步在体外比较研究两型TNF-α对高糖诱导的胰岛素抵抗的影响及其分子机制。
主要缩略词表第5-6页
第一部分 人 TNFR1-PLAD 及其突变体基因克隆与表达纯化及其生物学活性鉴定第6-40页
    中文摘要第7-8页
    ABSTRACT第8-9页
    前言第9-12页
    材料与方法第12-27页
    实验结果第27-36页
    讨论第36-38页
    结论第38-39页
    参考文献第39-40页
第二部分 小鼠 TNF-α及其突变体基因克隆与表达鉴定第40-64页
    中文摘要第41-42页
    ABSTRACT第42-43页
    前言第43-46页
    材料与方法第46-52页
    实验结果第52-60页
    讨论第60-61页
    结论第61-62页
    参考文献第62-64页
综述第64-82页
    参考文献第73-82页
致谢第82页
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