BMPR-IB基因作为贵州白山羊多胎性候选基因的研究

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绵羊的多胎性状是养羊业获得更多经济效益的重要途径。近年来在澳大利亚Booroola羊发现其存在多胎基因(FceB),并对其遗传特点、遗传效应等进行了广泛研究。随后的几年内,以其为候选基因在不同国家的绵羊品种中进行了更为广泛的发掘,我国在湖羊和小尾寒羊两个品种中都检测到了该基因,但是多胎基因在我国山羊中一直没有明确的报道。本研究采用贵州白山羊主要产区随机抽样法,在贵州省德江、惠水、睛隆、天柱和毕节等县的山羊养殖基地抽取了227只不同产羔率的贵州白山羊。在实验室采用PCR-RFLP、PCR-SSCP和Tetra-ARMS PCR方法分析了贵州白山羊多胎性候选基因BMPR-IB基因第5外显子至第10外显子在贵州白山羊中的多态性,并从分子水平探索贵州白山羊多胎性状的分子遗传机理。实验结果如下:1.在BMPR-IB基因第5外显子至第10外显子分别设计6对特异性引物,扩增出目的片段后进行PCR-SSCP分析,建立了最佳PCR-SSCP条件,对227只贵州白山羊进行了检测,结果只存在AA型个体。2.对BMPR-IB基因外显子6的扩增片段进行了RFLP分析。为便于检测大量样品,在引物R6中引入了一个点突变,使突变基因型的PCR产物产生一个AvaⅡ酶切位点,而非突变型样品中不含有该位点不能被切割。对227份贵州白山羊血液样品进行RFLP分析,均为1条140bp带,没有发现外显子6有单碱基突变,与其SSCP的检测结果一致。根据四引物ARMS-PCR的原理,设计两对特异性引物对BMPR-IB基因第6外显子进行扩增。对所采集到的227份贵州白山羊样品DNA进行检测,没有发现外显子6编码区746位有单核苷酸多态性,与其SSCP的检测结果一致。对贵州白山羊BMPR-IB基因的分析表明,BMPR-IB基因外显子5至外显子10中没有发现碱基突变,说明从绵羊、人的BMPR-IB基因中重要结构域GS和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域发现的碱基突变在贵州白山羊中的自然发生率低,该基因在贵州白山羊群体中很保守,提示BMPR-IB蛋白的高度保守性对山羊的发育调控具有重要的意义。
中文摘要第6-7页
Abstract第7-8页
一、前言第9-31页
    1.1 骨骼形态发生蛋白受体(BMPR)的研究进展第9-14页
        1.1.1 BMPR第9-10页
        1.1.2 BMPR的信号传递机制第10-11页
        1.1.3 BMPR的功能第11-12页
        1.1.4 BMPR-IB基因第12-14页
    1.2 山羊繁殖性状基因第14-16页
    1.3 绵羊和山羊繁殖性状基因多态性研究第16-25页
        1.3.1 RFLP标记第16-17页
        1.3.2 RAPD标记第17-18页
        1.3.3 AFLP标记第18-19页
        1.3.4 微卫星标记第19-21页
        1.3.5 SSCP标记第21-22页
        1.3.6 SNP标记第22-24页
        1.3.7 Tetra-ARMS(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR)标记第24-25页
    1.4 贵州白山羊第25-31页
        1.4.1 产地和分布第25-26页
        1.4.2 特征和特性第26-29页
        1.4.3 生产和应用第29-31页
二、论文研究的目的和意义第31-32页
三、实验材料与方法第32-49页
    3.1 实验材料第32-35页
        3.1.1 实验动物及血样第32页
        3.1.2 实验仪器和试剂第32-35页
    3.2 引物的设计和合成第35-36页
    3.3 实验方法第36-47页
        3.3.1 血液基因组DNA的提取(E.Z.N.A.SQ Blood DNA Kit)第36页
        3.3.2 目的基因的扩增第36-37页
        3.3.3 PCR产物的检测第37-38页
        3.3.4 BMPR-IB基因外显子6的PCR-RFLP分析第38-39页
        3.3.5 PCR扩增产物的PCR-SSCP分析及基因型判定第39-40页
        3.3.6 Tetra-ARMS PCR检测BMPR-IB基因第6外显子第40-43页
        3.3.7 胶回收第43-44页
        3.3.8 DNA和载体酶切第44页
        3.3.9 DNA的连接第44页
        3.3.10 感受态细胞的制备及转化第44-46页
        3.3.11 阳性菌落的筛选与鉴定第46-47页
    3.4 碱基序列的测定第47-48页
    3.5 分析软件第48-49页
四、结果第49-55页
    4.1 BMPR-IB基因PCR的扩增第49-52页
        4.1.1 BMPR-IB基因外显子6 DNA片段的扩增第49页
        4.1.2 BMPR-IB基因外显子5 PCR产物的扩增结果第49-50页
        4.1.3 BMPR-IB基因外显子7 PCR产物的扩增结果第50页
        4.1.4 BMPR-IB基因外显子8 PCR产物的扩增结果第50-51页
        4.1.5 BMPR-IB基因外显子9 PCR产物的扩增第51页
        4.1.6 BMPR-IB基因外显子10 PCR产物的扩增结果第51-52页
    4.2 BMPR-IB基因外显子6的PCR-RFLP检测第52页
    4.3 四引物ARMS-PCR的检测结果第52-53页
    4.4 BMPR-IB基因PCR-SSCP多态性检测结果第53-55页
        4.4.1 SSCP检测结果基因型命名第53页
        4.4.2 BMPR-IB基因外显子6的PCR-SSCP检测结果第53页
        4.4.3 BMPR-IB基因外显子5的PCR-SSCP检测结果第53页
        4.4.4 BMPR-IB基因外显子7的PCR-SSCP检测结果第53-54页
        4.4.5 BMPR-IB基因外显子8的PCR-SSCP检测结果第54页
        4.4.6 BMPR-IB基因外显子9的PCR-SSCP检测结果第54页
        4.4.7 BMPR-IB基因外显子10的PCR-SSCP检测结果第54-55页
五、讨论第55-60页
    5.1 关于贵州白山羊BMPR-IB基因外显子6的多态性检测结果第55-56页
    5.2 关于贵州白山羊BMPR-IB基因外显子5、外显子7至外显子10的多态性检测结果第56页
    5.3 影响PCR-SSCP检测的因素第56-60页
        5.3.1 PCR产物的质量第57页
        5.3.2 DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响第57页
        5.3.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶成分第57-58页
        5.3.4 上样缓冲液与变性第58页
        5.3.5 电泳条件第58页
        5.3.6 其它因素第58-60页
六、小结第60-61页
七、参考文献第61-67页
附录第67-68页
缩略语表第68-69页
致谢第69-71页
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