黄芩毛状根培养体系优化研究-Ⅲ

黄芩苷（Bacalin）为黄酮类化合物，大量存在于药用植物黄芩（Scutellariabaicalensis Georgi）的根部，具有清除氧自由基、抗氧化、免疫调节、抗炎、抗病毒（如HIV）和抗肿瘤的作用。近年来，随着医药科技的发展，以黄芩苷及中药黄芩为主要原料的药品开发和生产与日俱增，而黄芩的种植面积却逐年降低。农药的大量施用、药材产地的污染等使药材的质量与安全问题也日渐严重。探索可替代中药黄芩的新资源将对中医药发展有重要意义。本论文以优选的黄芩毛状根为研究材料，对黄芩毛状根的种属、黄酮类成分合成的影响因素、黄芩苷合成的调控进行了研究。此外，本论文构建了含透明颤菌血红蛋白基因的发根农杆菌，为改善黄芩毛状根抗低氧能力奠定了基础。研究结果如下：1.利用双引物扩增黄芩毛状根内转录间隔区（Internal TranscribedSpacer，ITS），其ITS为589bp。利用BLAST软件进行ITS序列比对，表明该序列与黄芩属黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）（登录号：AB557593.1）同源性为90%。获得黄芩毛状根的ITS登录号为JF824665。表明研究所用黄芩毛状根外植体来源于黄芩属黄芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）。2.黄芩毛状根的HPLC指纹图谱分析结果表明：黄芩毛状根具有合成黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷及汉黄芩素等黄酮类成分的能力，其中以黄芩苷为主。以果糖为碳源培养的黄芩毛状根培养30-50d时与黄芩药材相似度从0.660逐渐提高到0.987；以蔗糖或葡萄糖为碳源时，培养30-50d的黄芩毛状根与黄芩药材相似度均高于0.9。利用黄芩毛状根自身所具备的水解酶系对其水解并进行高效液相指纹图谱研究，结果表明黄芩毛状根与黄芩药材酶解后的指纹图谱相似度为0.969，表明黄芩毛状根存在水解酶系。3.建立了三级黄芩毛状根的培养体系。黄芩毛状根一级种子培养工艺为接种量5g/L，50g/L葡萄糖的改良MS液体培养基28℃培养18d，摇床转速110rpm。二级种子培养工艺为接种量5g/L，含0.2mmol/L苯丙氨酸、40g/L蔗糖、10g/L葡萄糖的改良MS液体培养基28℃培养20d，摇床转速110rpm。黄芩毛状根三级培养工艺为接种量5g/L，含0.4mmol/L苯丙氨酸、60g/L蔗糖的改良的MS液体培养基采用20d变温法（0-20d28℃培养，21-40d20℃培养）培养40d，摇床转速为110rpm。利用三级培养体系获得的毛状根生物量为11.52g/L，黄芩苷含量为20.99%。4.为实现在线监测黄芩毛状根的生物量，对生物量增殖y（g/L）与电导率x（mS/cm）的相关性进行研究，得到方程：y=7.090x3－30.886x+24.914(R2=0.998)，本方程可用于黄芩毛状根生物量的在线监测。5.为了提高黄芩毛状根的抗低氧能力，本研究将pBI121-VHb质粒转化15834及R1000发根农杆菌。为VHb基因转入黄芩毛状根中提供了有效工具。