一、研究背景背根神经节在神经病理性疼痛的发病机制中起着重要作用。许多研究证明背根神经节的多种钾离子通道亚型的变化是神经病理性疼痛发生、发展的必要条件。TRESK,编码KCNK18基因,是近年来新发现的一个双孔钾离子通道亚型,在背根神经节中大量表达。其主要功能是维持神经元细胞的静息电位,在神经元细胞兴奋过程中起着重要作用。越来越多的研究证明了TRESK可能参与各型疼痛的发生过程,但目前并未有关于背根神经节的TRESK参与神经病理性疼痛的研究。二、目的本研究首先观察坐骨神经分支选择性损伤诱发神经病理性疼痛的大鼠模型中背根神经节TRESKmRNA的变化。在成功构建了TRESK基因重组腺病毒载体后,转染背根神经节神经元细胞,验证其转染和上调TRESKmRNA的效率,并研究TRESK基因上调对背根神经节细胞P物质释放的影响。另外,对坐骨神经分支选择性损伤诱发神经病理性疼痛大鼠鞘内注射TRESK基因重组腺病毒载体,验证其在体上调大鼠背根神经节TRESKmRNA和蛋白的效果,并观察此变化对神经病理性疼痛大鼠痛阈的影响以及对脊髓胶质细胞激活程度的影响。探讨背根神经节的TRESK在神经病理性疼痛中的作用。三、方法实验分四部分：1.雄性SD大鼠32只,随机分为2组,假手术组(Shame组,n=16)和坐骨神经分支选择性损伤组(SNI组,n=16)。两组大鼠各取8只术前1d处死,取L4,5术侧的DRG,realtime PCR检测TRESKmRNA表达；各组余下8只大鼠分别与术前1d及术后1、3、5、7、14d分别测定机械痛阈和热痛阈,术后14d处死,realtime PCR检测L4,5术侧DRG的TRESKmRNA表达。2.从大鼠背根神经节细胞中克隆TRESK全长cDNA, PCR鉴定及DNA测序验证；构建以CMV启动子转录调控的pAd/CMV/V5-DEST-TRESK。转化DH5α大肠杆菌,挑取阳性重组克隆行PCR鉴定、酶切鉴定后,再取阳性克隆后行DNA测序。将测序正确的质粒经PacI酶切线性化,转染包装293T细胞,包装产生TRESK基因重组的腺病毒载体,逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。3.原代培养大鼠背根神经节细胞,随机分为6组,每组9孔。对照组(C组)：不行任何处理；辣椒素组(S组)：300nmol/L辣椒素的新鲜培养液孵育10min；阴性对照组(NC组)：每孔加入3×109个阴性对照腺病毒；阴性对照+辣椒素组(NCS组)：每孔加入3×109阴性对照腺病毒,72h后,300nmol/L辣椒素的新鲜培养液孵育10min; TRESK基因重组腺病毒组(R组)：每孔中加入3×109个TRESK基因重组腺病毒pAd/CMV/V5-DEST-TRESK; TRESK基因重组腺病毒+辣椒素组(RS组)：每孔中加入3×109个TRESK基因重组腺病毒pAd/CMV/V5-DEST-TRESK,72h后,300nmol/L辣椒素的新鲜培养液孵育10min。各组于48h后采用realtime PCR检测’TRESKmRNA表达；72h后分别用Western blot法和放射免疫分析法检测TRESK蛋白和SP的释放。4.雄性SD大鼠108只,随机分为6组(n=18)：Ⅰ组为空白对照组；Ⅱ组为假手术组；Ⅲ组制备坐骨神经分支选择性损伤(SNI)大鼠模型；Ⅳ组制备SNI大鼠模型后再鞘内注射生理盐水；V组制备SNI大鼠模型后再鞘内注射阴性腺病毒；Ⅵ组制备SNI大鼠模型后再鞘内注射TRESK基因重组腺病毒pAd/CMV/V5-DEST-TRESK。各组分别与术前1d及术后1、3、5、7、14d分别测定机械痛阈和热痛阈。术后14d处死,取L4,5术侧DRG,每组6只realtime PCR检测L4,5术侧DRG的TRESKmRNA表达,再取6只检测L4,5术侧DRG的TRESK蛋白表达,剩余6只大鼠取L4,5脊髓,免疫组织化学观察脊髓胶质细胞的激活程度。四、结果1.SNI组术后1～14d时的机械痛阈明显低于Shame组(P<0.05),SNI组术后14d术侧L4,5DRG的TRESKmRNA表达明显低于Shame组(P<0.05)；与术前组内比较,SNI组术后1～14d时的MWT明显降低(P<0.05),SNI组术后14d术侧L4,5DRG的TRESKmRNA表达明显降低(P<0.05)。2.从大鼠DRG细胞中克隆的TRESK全长cDNA为781bp, DNA测序验证DNA序列与GeneBank中收录的大鼠TRESK序列完全一致。以pAD-GFP空载体为对照,pAD/CMV/V5-DEST-TRESK gDNA为模板的PCR扩增,目的片段781bp,鉴定结果与预期相符。腺病毒滴度为1.31×109TU/ml。3.与C组比较,R组、RS组大鼠DRG细胞的TRESKmRNA表达水平均明显升高(P<0.05),S组、NCS组大鼠DRG细胞的TRESKmRNA表达水平均明显降低(P<0.05)。与C组比较,R组、RS组大鼠DRG细胞的TRESK蛋白表达水平均明显增高(P<0.05)；S组、NCS组大鼠DRG细胞的TRESK蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。与C组比较,S组、NCS组、RS组大鼠DRG细胞的SP水平均明显增高(P<0.05)；S组、NCS组大鼠DRG细胞的SP水平均明显高于RS组(P<0.05)。4.Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组术后1～14d时的机械痛阈明显低于Ⅰ组(P<0.05),Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组5、7、14d时的机械痛阈明显低于Ⅵ组(P<0.05)；与术前比较,Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组术后1～14d时的机械痛阈明显降低(P<0.05)。Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组L4,5术侧DRG的TRESKmRNA表达明显低于Ⅰ组(P<0.05),Ⅵ组L4,5术侧DRG的TRESKmRNA表达明显高于Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组(P<0.05)。Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组L4,5术侧DRG的TRESK蛋白表达明显低于Ⅰ组(P<0.05),Ⅵ组L4,5术侧DRG的TRESK蛋白表达明显高于Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组(P<0.05)。Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组脊髓胶质细胞激活明显高于Ⅰ组(P<0.05)；Ⅵ组脊髓胶质细胞激活明显低于Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组(P<0.05)。五、结论1.神经病理性疼痛会导致背根神经节的TRESKmRNA下调,神经病理性疼痛的发生、发展可能与背根神经节的TRESK密切相关。2.成功克隆了大鼠TRESK全长cDNA,并构建其重组腺病毒表达载体：pAD/CMV/V5-DEST-TRESK,腺病毒滴度为1.31×109TU/ml。3. TRESK基因重组腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST-TRESK可有效地上调大鼠原代背根神经节细胞TRESKmRNA及其蛋白的表达；TRESK基因上调可抑制辣椒素诱发的大鼠背根神经节细胞P物质的释放。4.鞘内注射TRESK基因重组腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST-TRESK对大鼠神经病理性疼痛有治疗作用。其通过上调DRC中的TRESKmRNA和蛋白表达可抑制脊髓的星形胶质细胞激活,达到治疗神经病理性疼痛的作用。
