桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica (L.) Batsch或山桃Prunus davidiana (Carr.)Franch.的干燥成熟种子,果实成熟后采收,除去果肉和核壳,取出种子,晒干。性平味苦甘,归心、肝、大肠经。功能为活血祛瘀,润肠通便,止咳平喘,孕妇慎用。本品始载于《神农本草经》,现代研究表明桃仁对心脑血管疾病疗效显著,近年来受到广泛关注,但一直以来对桃仁的有效成分缺乏系统的研究,也没有具体的质量评价系统,致使桃仁药材市场流通处于混乱。故本试验采用TLC、HPLC以及指纹图谱法对采自山东、山西以及河北承德、安国等不同产地和不同品种的15份桃仁进行质量研究,为评价桃仁质量及临床合理用药提供科学依据。目的:通过试验对不同产地和品种桃仁的研究,建立桃仁药材的薄层色谱、含量测定及指纹图谱的方法,为科学评价与有效控制桃仁的质量提供依据。方法:1薄层色谱方法的建立(1)提取条件:考察不同的提取方法和提取溶剂对结果的影响,选用适宜的提取方法和提取溶剂。(2)展开条件:根据桃仁药材中主要指标成分化学性质的特点,确定适宜的固定相、展开系统、显色系统等。2含量测定方法的建立(1)提取条件:考察不同提取方法、不同提取溶剂对提取桃仁药材中主要指标成分的影响,继而选取影响提取效率的三个主要因素:溶剂用量、提取时间、提取次数,采用正交设计对含量测定的前处理工艺进行优化,以选择提取效率较高的提取条件。(2)色谱条件:选择适宜的固定相,调整流动相的组成、配比、流速、进样量,调节柱温以使苦杏仁苷色谱峰与其它杂质峰完全分离。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察苦杏仁苷色谱峰的理论板数、分离度。(4)标准曲线的绘制:配制系列浓度的苦杏仁苷对照品溶液,分别进样,测定峰面积,以苦杏仁苷进样量为横坐标,相应峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。(5)精密度试验:取同一份对照品溶液和供试品溶液,分别重复进样6次,测定峰面积。(6)重复性试验:取同一批桃仁药材6份,制备供试品溶液,分别进样,测定峰面积。(7)稳定性试验:分别取同一份对照品溶液和供试品溶液,分别于放置0,4,8,12,24,48 h后进样,测定峰面积。(8)回收率试验:取已知苦杏仁苷含量的桃仁药材适量,分别加入等量的苦杏仁苷对照品,测定苦杏仁苷的含量,计算平均回收率和RSD值。(9)最低限检测的测定:将苦杏仁苷对照品溶液逐步稀释,当信噪比S/N≥3时确定为最低检测限。(10)样品测定:在上述色谱条件下,测定15批桃仁药材中苦杏仁苷的含量。3指纹图谱方法的建立(1)提取条件:比较不同提取溶剂、不同提取方法及不同提取时间的提取效果,选择提取成分较多,提取率较高的提取条件。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱、检测器及检测波长,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使色谱图符合指纹图谱研究的要求。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察苦杏仁苷色谱峰的理论板数、分离度。(4)精密度试验:制备样品溶液1份,重复进样6次,记录保留时间和峰面积,考察试验方法的精密度。(5)重复性试验:平行制备样品溶液6份,分别进样,记录保留时间和峰面积,考察试验方法的重复性。(6)稳定性试验:制备样品溶液1份,分别放置0,4,8,12,24,48 h后进样,记录保留时间和峰面积,考察试验方法的稳定性。(7)指纹图谱的建立:分别取同一品种不同产地桃仁药材10批,其他不同品种的桃仁药材5批,制备供试品溶液,进行指纹图谱分析,相似度评价。结果:1薄层色谱方法:(1)提取方法:样品加甲醇10 ml,超声处理30 min,离心,取上清液作为供试品溶液。(2)展开条件:以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)5-10℃放置12 h的下层溶液为展开剂,展开,取出,挥干溶剂后以0.8%磷钼酸的15%硫酸乙醇溶液(现用现配)浸板,在105℃加热至斑点显色清晰,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。2含量测定方法:(1)提取条件:确定了对桃仁进行含量测定的前处理工艺:50倍甲醇超声提取一次,提取时间为30 min。(2)色谱条件:采用安捷伦C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);以甲醇～水(15:85)为流动相;流速1.0 ml/min;柱温30℃;检测波长为210 nm;进样量10μl。在此色谱条件下,苦杏仁苷峰保留时间约为12 min,分离度大于1.5,理论塔板数不低于4000。(3)标准曲线的绘制:苦杏仁苷在0.138～13.8μg范围内,线性关系良好。回归方程为Y=513.57X+20.704, r=0.9999(n=6)(4)精密度试验:仪器和方法的精密度良好,RSD分别为0.71%、1.22%。(5)重复性试验:样品的重复性良好,RSD为0.53%。(6)稳定性试验:对照品和样品在48 h内均稳定,RSD分别为1.44%、0.96%。(7)回收率试验:样品平均回收率为99.57%,RSD为2.50%。(8)苦杏仁苷的最低检测限为40.1032 ng(。9)桃仁药材中苦杏仁苷的含量为2.332%～3.532%。3指纹图谱方法:(1)提取:以70%甲醇超声60 min为佳,具有稳定和效率高等优点。(2)色谱条件:色谱柱为Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);乙腈～水为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 ml/min,柱温为30℃,检测波长为225 nm,进样量10μl。(3)系统适用性试验:在此色谱条件下,苦杏仁苷的保留时间约为20 min,理论板数按苦杏仁苷峰计算约为50000,与其它色谱峰的分离度大于1.0。(4)精密度试验:以苦杏仁苷峰为内参比峰,计算各主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积5%以上峰的峰面积值,其RSD值分别为0.024%～0.137%和0.278%～1.621%,精密度良好。(5)重复性试验:各主要色谱峰相对保留时间和占总峰面积5%以上色谱峰的相对峰面积均无明显变化,其RSD分别为0.069%～0.573%和1.075%～2.269%,重复性良好。(6)稳定性试验:各主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积5%以上峰的峰面积比值均无明显变化,其RSD分别为0.004%～0.245%和1.075%～1.951%,稳定性良好。(7)指纹图谱的建立:得到桃仁药材的指纹图谱及15个共有峰,同时得到不同品种来源桃仁药材的指纹图谱。(8)数据分析:运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004年A版(国家药典委员会开发)对所得数据进行分析,所得结果能反映桃仁药材的质量。结论:1薄层色谱:该方法显现斑点清晰,重复性和稳定性良好,能够更好的作为桃仁的定性鉴别方法。2含量测定:以苦杏仁苷含量为其主要质量指标,建立了该药材定量分析方法,该方法稳定性,重复性和精密度良好,为科学评价与有效控制桃仁的质量提供了科学依据。3指纹图谱:通过建立桃仁的HPLC指纹图谱,得到特征对照图谱,计算相似度,该方法重复性和精密度良好,有助于桃仁的质量控制,同时为桃仁药材的鉴别提供了新的依据。
