耳廓软骨细胞生物学特性研究及组织工程软骨的体外构建初探
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获得来源广泛、具有稳定表型和良好增殖能力的种子细胞是体外构建组织工程软骨并进行关节软骨缺损及其他软骨损伤修复的前提。异体软骨细胞与自体软骨细胞、骨膜细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞等相比具有来源广泛、不给病人带来额外痛苦等优点,而猪的细胞、组织和器官常用于代替人体细胞、组织和器官移植。本研究以关中黑猪为实验动物,对软骨细胞分离、培养和鉴定方法及体外扩增的途径进行了探讨,并以所得的软骨细胞对组织工程软骨体外构建的技术方法进行了初步尝试。 试验采用 0.25%胰蛋白酶和 0.2%Ⅱ型胶原酶配合消化的方法分离关中黑猪耳廓软骨细胞,并在体外进行培养,同时相差显微镜下观察软骨细胞生长的形态学变化、测定细胞克隆率和冷冻复苏率、绘制生长曲线,并运用甲苯胺蓝染色和免疫组织学方法检测不同时期软骨细胞的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原分泌情况。结果表明:用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶配合消化的方法可以成功分离耳廓软骨细胞;软骨细胞在体外培养的过程中表现为多形性,有圆形、短梭形、多角形等;随着传代次数增多,软骨细胞逐渐向成纤维样细胞转变,并有少量肥大细胞出现;糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的分泌也随传代次数增加而减少。单纯游离细胞培养 3 代后细胞成纤维化较多,而与未完全消化的组织块共培养的细胞体外培养 6 代后大多数细胞能维持短梭形,仍可见细胞质中有一些分泌小泡。 另对关中黑猪耳廓软骨细胞在添加 10%FBS、5%BFF、10%BFF、20%BFF、5ng/mlEGF、20ng/mEGF 或 40ng/ml EGF 的 F12 培养液中的增殖和表型变化还进行了研究。结果显示:以 10%BFF 替代 FBS 作为培养液蛋白源培养软骨细胞,能促进其增殖和细胞外基质的分泌,与对照组相比差异显著(P<0.05);添加 20ng/ml EGF 的培养液也能促进软骨细胞的增殖,与对照组相比差异极显著(P<0.01),但对细胞表型特征的变化没有影响;20ng/mlEGF 组增殖效果优于10%BFF 组,差异极显著(P<0.01)。 此外,试验还用所得软骨细胞在离心管中无支架培养构建工程化软骨进行了初步尝试。试验获得外观呈软骨样组织块 4 块,在用镊子夹取时其中 3 块碎裂。剩下的软骨样组织外观呈乳白色,直径约 3mm左右,略带光泽。 综上述试验结果,得出如下结论: 1. 采用 0.25%胰蛋白酶和 0.2%Ⅱ型胶原酶配合消化的方法能成功地从关 中黑猪耳廓软骨分离出具有活性的软骨细胞。<WP=7>2. 与未完全消化的组织块共培养可为软骨细胞的生长提供一个与正常生理 条件相似的生长环境,有利于软骨细胞经多次传代后的正常增殖和表 型维持。3. 用 BFF 替代 FBS 培养软骨细胞能较好地促进细胞增殖,并能维持软骨 细胞的表型,以添加 10%BFF的培养液促增殖效果最好。4. 添加 EGF 也能提高软骨细胞的增殖速率,但对软骨细胞去分化现象没 有明显的响,即不能抑制软骨细胞向成纤维样细胞的改变。5. 在离心管中无支架培养得到外观呈软骨样的组织块。
中文摘要 | 第6-8页 |
英文摘要 | 第8页 |
综述部分 | 第14-35页 |
第一章 组织工程软骨的研究进展 | 第14-28页 |
1 组织工程软骨种子细胞的研究 | 第14-16页 |
1.1 种子细胞的种类 | 第14-16页 |
1.1.1 自体或异体软骨细胞 | 第14-15页 |
1.1.2 骨膜/软骨膜细胞 | 第15页 |
1.1.3 干细胞 | 第15-16页 |
1.1.3.1 骨髓间充质干细胞 | 第15-16页 |
1.1.3.2 胚胎干细胞 | 第16页 |
1.1.4 永生化软骨细胞 | 第16页 |
2 影响软骨细胞增殖的因素 | 第16-21页 |
2.1 生长因子的影响 | 第16-19页 |
2.1.1 TGF-β | 第17页 |
2.1.2 BMPs | 第17页 |
2.1.3 EGF | 第17-18页 |
2.1.4 IGFs | 第18页 |
2.1.5 FGFs | 第18页 |
2.1.6 PDGF | 第18-19页 |
2.1.7 HGF | 第19页 |
2.2 激素对软骨细胞生长的影响 | 第19-20页 |
2.2.1 雌激素 | 第19页 |
2.2.2 甲状腺素和甲状旁腺素 | 第19-20页 |
2.2.3 糖皮质激素 | 第20页 |
2.3 中药对软骨细胞生长的影响 | 第20-21页 |
2.4 铜对软骨细胞生长的影响 | 第21页 |
3 组织工程软骨支架材料的研究 | 第21-23页 |
3.1 天然细胞外 | 第22页 |
3.2 人工合成的细胞外基质 | 第22-23页 |
4 组织工程化软骨种子细胞培养体系 | 第23-25页 |
4.1 单层细胞培养 | 第23-24页 |
4.2 三维立体细胞培养 | 第24页 |
4.3 生物反应器培养体系 | 第24-25页 |
4.3.1 机械搅拌式生物反应器 | 第24页 |
4.3.2 微载体生物反应器 | 第24页 |
4.3.3 灌注式生物反应器 | 第24-25页 |
4.3.4 旋转式微重力生物反应器 | 第25页 |
5 组织工程软骨的发展方向 | 第25-28页 |
5.1 种子细胞的选择 | 第25-26页 |
5.2 生长因子应用的优化 | 第26页 |
5.3 体外培养微环境的改进 | 第26页 |
5.4 支架材料表面的修饰 | 第26-27页 |
5.5 改善工程化软骨生物相容性 | 第27-28页 |
第二章 软骨细胞凋亡研究进展 | 第28-35页 |
1 软骨细胞凋亡的形态学、生化特征及检测手段 | 第28-30页 |
1.1 一般细胞凋亡的形态学特征 | 第28页 |
1.2 细胞凋亡的一般生化特征和软骨细胞凋亡的特征 | 第28-29页 |
1.3 细胞凋亡的检测方法 | 第29-30页 |
1.3.1 形态学检测 | 第29页 |
1.3.2 磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V 法) | 第29-30页 |
1.3.3 线粒体膜势能的检测 | 第30页 |
1.3.4 DNA 片断化检测 | 第30页 |
1.3.5 Caspase-3 活性的检测 | 第30页 |
2 软骨细胞凋亡的发生机制 | 第30-32页 |
2.1 NO 途径 | 第30-31页 |
2.2 Fas 途径 | 第31页 |
2.3 与软骨细胞凋亡的相关基因 | 第31-32页 |
3 诱导与抑制凋亡的因素 | 第32-33页 |
3.1 影响软骨细胞的凋亡的细胞因子 | 第32页 |
3.2 软骨细胞外基质 | 第32-33页 |
3.3 影响软骨细胞凋亡的其他因素 | 第33页 |
4 细胞凋亡的生物学意义 | 第33-35页 |
试验部分 | 第35-46页 |
第三章 关中黑猪耳廓软骨细胞的分离、培养与鉴定 | 第35-39页 |
1 材料与方法 | 第35-36页 |
1.1 实验动物 | 第35页 |
1.2 仪器、试剂及试剂 | 第35页 |
1.3 方法 | 第35-36页 |
1.3.1 软骨细胞的分离与培养 | 第35页 |
1.3.2 生长曲线的绘制 | 第35-36页 |
1.3.3 克隆率的测定 | 第36页 |
1.3.4 细胞鉴定 | 第36页 |
1.3.5 冷冻复苏 | 第36页 |
2 结果 | 第36-37页 |
2.1 倒置显微镜下观察结果 | 第36页 |
2.2 生长曲线 | 第36-37页 |
2.3 软骨细胞的克隆率 | 第37页 |
2.4 甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原 SABC 法染色 | 第37页 |
2.5 冷冻复苏 | 第37页 |
3 讨论 | 第37-38页 |
3.1 耳廓软骨作为种子细胞供区的优势 | 第37页 |
3.2 维持软骨细胞的表型的途径 | 第37-38页 |
4 小结 | 第38-39页 |
第四章 牛卵泡液及 EGF 对软骨细胞生物学特性的影响 | 第39-44页 |
1 材料与方法 | 第39-40页 |
1.1 实验材料 | 第39页 |
1.2 仪器、试剂及耗材 | 第39页 |
1.3 软骨细胞的分离与培养 | 第39-40页 |
1.4 EFF 和 EGF 对软骨细胞生物学特性影响试验 | 第40页 |
1.4.1 BFF 和 EGF 对软骨细胞增殖影响试验 | 第40页 |
1.4.2 BFF 对软骨细胞表型特征影响试验 | 第40页 |
2 结果 | 第40-41页 |
2.1 BFF 和 EGF 对软骨细胞增殖的影响 | 第40-41页 |
2.2 BFF 对软骨细胞表型特征的影响 | 第41页 |
3 讨论 | 第41-43页 |
3.1 卵泡液对软骨细胞生长的影响 | 第41-42页 |
3.2 EGF 对软骨细胞生物学特性的影响 | 第42-43页 |
4 小结 | 第43-44页 |
第五章 组织工程软骨体外构建技术初探 | 第44-46页 |
1 材料和方法 | 第44-45页 |
1.1 实验材料 | 第44页 |
1.2 仪器、试剂及耗材 | 第44页 |
1.3 软骨细胞的分离与培养 | 第44页 |
1.4 离心管中无支架培养 | 第44-45页 |
2 结果 | 第45页 |
2.1 离心管中无支架培养 | 第45页 |
3 讨论 | 第45页 |
4 小结 | 第45-46页 |
结论 | 第46-47页 |
附图 | 第47-50页 |
参考文献 | 第50-62页 |
致谢 | 第62-63页 |
个人简介 | 第63页 |
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