耳廓软骨细胞生物学特性研究及组织工程软骨的体外构建初探

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获得来源广泛、具有稳定表型和良好增殖能力的种子细胞是体外构建组织工程软骨并进行关节软骨缺损及其他软骨损伤修复的前提。异体软骨细胞与自体软骨细胞、骨膜细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞等相比具有来源广泛、不给病人带来额外痛苦等优点,而猪的细胞、组织和器官常用于代替人体细胞、组织和器官移植。本研究以关中黑猪为实验动物,对软骨细胞分离、培养和鉴定方法及体外扩增的途径进行了探讨,并以所得的软骨细胞对组织工程软骨体外构建的技术方法进行了初步尝试。 试验采用 0.25%胰蛋白酶和 0.2%Ⅱ型胶原酶配合消化的方法分离关中黑猪耳廓软骨细胞,并在体外进行培养,同时相差显微镜下观察软骨细胞生长的形态学变化、测定细胞克隆率和冷冻复苏率、绘制生长曲线,并运用甲苯胺蓝染色和免疫组织学方法检测不同时期软骨细胞的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原分泌情况。结果表明:用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶配合消化的方法可以成功分离耳廓软骨细胞;软骨细胞在体外培养的过程中表现为多形性,有圆形、短梭形、多角形等;随着传代次数增多,软骨细胞逐渐向成纤维样细胞转变,并有少量肥大细胞出现;糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的分泌也随传代次数增加而减少。单纯游离细胞培养 3 代后细胞成纤维化较多,而与未完全消化的组织块共培养的细胞体外培养 6 代后大多数细胞能维持短梭形,仍可见细胞质中有一些分泌小泡。 另对关中黑猪耳廓软骨细胞在添加 10%FBS、5%BFF、10%BFF、20%BFF、5ng/mlEGF、20ng/mEGF 或 40ng/ml EGF 的 F12 培养液中的增殖和表型变化还进行了研究。结果显示:以 10%BFF 替代 FBS 作为培养液蛋白源培养软骨细胞,能促进其增殖和细胞外基质的分泌,与对照组相比差异显著(P<0.05);添加 20ng/ml EGF 的培养液也能促进软骨细胞的增殖,与对照组相比差异极显著(P<0.01),但对细胞表型特征的变化没有影响;20ng/mlEGF 组增殖效果优于10%BFF 组,差异极显著(P<0.01)。 此外,试验还用所得软骨细胞在离心管中无支架培养构建工程化软骨进行了初步尝试。试验获得外观呈软骨样组织块 4 块,在用镊子夹取时其中 3 块碎裂。剩下的软骨样组织外观呈乳白色,直径约 3mm左右,略带光泽。 综上述试验结果,得出如下结论: 1. 采用 0.25%胰蛋白酶和 0.2%Ⅱ型胶原酶配合消化的方法能成功地从关 中黑猪耳廓软骨分离出具有活性的软骨细胞。<WP=7>2. 与未完全消化的组织块共培养可为软骨细胞的生长提供一个与正常生理 条件相似的生长环境,有利于软骨细胞经多次传代后的正常增殖和表 型维持。3. 用 BFF 替代 FBS 培养软骨细胞能较好地促进细胞增殖,并能维持软骨 细胞的表型,以添加 10%BFF的培养液促增殖效果最好。4. 添加 EGF 也能提高软骨细胞的增殖速率,但对软骨细胞去分化现象没 有明显的响,即不能抑制软骨细胞向成纤维样细胞的改变。5. 在离心管中无支架培养得到外观呈软骨样的组织块。
中文摘要第6-8页
英文摘要第8页
综述部分第14-35页
    第一章 组织工程软骨的研究进展第14-28页
        1 组织工程软骨种子细胞的研究第14-16页
            1.1 种子细胞的种类第14-16页
                1.1.1 自体或异体软骨细胞第14-15页
                1.1.2 骨膜/软骨膜细胞第15页
                1.1.3 干细胞第15-16页
                    1.1.3.1 骨髓间充质干细胞第15-16页
                    1.1.3.2 胚胎干细胞第16页
                1.1.4 永生化软骨细胞第16页
        2 影响软骨细胞增殖的因素第16-21页
            2.1 生长因子的影响第16-19页
                2.1.1 TGF-β第17页
                2.1.2 BMPs第17页
                2.1.3 EGF第17-18页
                2.1.4 IGFs第18页
                2.1.5 FGFs第18页
                2.1.6 PDGF第18-19页
                2.1.7 HGF第19页
            2.2 激素对软骨细胞生长的影响第19-20页
                2.2.1 雌激素第19页
                2.2.2 甲状腺素和甲状旁腺素第19-20页
                2.2.3 糖皮质激素第20页
            2.3 中药对软骨细胞生长的影响第20-21页
            2.4 铜对软骨细胞生长的影响第21页
        3 组织工程软骨支架材料的研究第21-23页
            3.1 天然细胞外第22页
            3.2 人工合成的细胞外基质第22-23页
        4 组织工程化软骨种子细胞培养体系第23-25页
            4.1 单层细胞培养第23-24页
            4.2 三维立体细胞培养第24页
            4.3 生物反应器培养体系第24-25页
                4.3.1 机械搅拌式生物反应器第24页
                4.3.2 微载体生物反应器第24页
                4.3.3 灌注式生物反应器第24-25页
                4.3.4 旋转式微重力生物反应器第25页
        5 组织工程软骨的发展方向第25-28页
            5.1 种子细胞的选择第25-26页
            5.2 生长因子应用的优化第26页
            5.3 体外培养微环境的改进第26页
            5.4 支架材料表面的修饰第26-27页
            5.5 改善工程化软骨生物相容性第27-28页
    第二章 软骨细胞凋亡研究进展第28-35页
        1 软骨细胞凋亡的形态学、生化特征及检测手段第28-30页
            1.1 一般细胞凋亡的形态学特征第28页
            1.2 细胞凋亡的一般生化特征和软骨细胞凋亡的特征第28-29页
            1.3 细胞凋亡的检测方法第29-30页
                1.3.1 形态学检测第29页
                1.3.2 磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V 法)第29-30页
                1.3.3 线粒体膜势能的检测第30页
                1.3.4 DNA 片断化检测第30页
                1.3.5 Caspase-3 活性的检测第30页
        2 软骨细胞凋亡的发生机制第30-32页
            2.1 NO 途径第30-31页
            2.2 Fas 途径第31页
            2.3 与软骨细胞凋亡的相关基因第31-32页
        3 诱导与抑制凋亡的因素第32-33页
            3.1 影响软骨细胞的凋亡的细胞因子第32页
            3.2 软骨细胞外基质第32-33页
            3.3 影响软骨细胞凋亡的其他因素第33页
        4 细胞凋亡的生物学意义第33-35页
试验部分第35-46页
    第三章 关中黑猪耳廓软骨细胞的分离、培养与鉴定第35-39页
        1 材料与方法第35-36页
            1.1 实验动物第35页
            1.2 仪器、试剂及试剂第35页
            1.3 方法第35-36页
                1.3.1 软骨细胞的分离与培养第35页
                1.3.2 生长曲线的绘制第35-36页
                1.3.3 克隆率的测定第36页
                1.3.4 细胞鉴定第36页
                1.3.5 冷冻复苏第36页
        2 结果第36-37页
            2.1 倒置显微镜下观察结果第36页
            2.2 生长曲线第36-37页
            2.3 软骨细胞的克隆率第37页
            2.4 甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原 SABC 法染色第37页
            2.5 冷冻复苏第37页
        3 讨论第37-38页
            3.1 耳廓软骨作为种子细胞供区的优势第37页
            3.2 维持软骨细胞的表型的途径第37-38页
        4 小结第38-39页
    第四章 牛卵泡液及 EGF 对软骨细胞生物学特性的影响第39-44页
        1 材料与方法第39-40页
            1.1 实验材料第39页
            1.2 仪器、试剂及耗材第39页
            1.3 软骨细胞的分离与培养第39-40页
            1.4 EFF 和 EGF 对软骨细胞生物学特性影响试验第40页
                1.4.1 BFF 和 EGF 对软骨细胞增殖影响试验第40页
                1.4.2 BFF 对软骨细胞表型特征影响试验第40页
        2 结果第40-41页
            2.1 BFF 和 EGF 对软骨细胞增殖的影响第40-41页
            2.2 BFF 对软骨细胞表型特征的影响第41页
        3 讨论第41-43页
            3.1 卵泡液对软骨细胞生长的影响第41-42页
            3.2 EGF 对软骨细胞生物学特性的影响第42-43页
        4 小结第43-44页
    第五章 组织工程软骨体外构建技术初探第44-46页
        1 材料和方法第44-45页
            1.1 实验材料第44页
            1.2 仪器、试剂及耗材第44页
            1.3 软骨细胞的分离与培养第44页
            1.4 离心管中无支架培养第44-45页
        2 结果第45页
            2.1 离心管中无支架培养第45页
        3 讨论第45页
        4 小结第45-46页
结论第46-47页
附图第47-50页
参考文献第50-62页
致谢第62-63页
个人简介第63页
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