利用超声波介导花粉转化法获得转植酸酶玉米的研究
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玉米是重要的粮食、饲料和工业原料。作为饲料,玉米中含有丰富的磷,主要以植酸磷的形式存在,但是单胃动物由于不能分泌植酸酶而无法利用,大量的磷排泄到体外,污染环境。因此,利用生物技术手段提高玉米中的植酸酶含量,可以有效提高磷的利用率。本研究以5种不同的优良玉米品系(分别为:郑单958、78599、四487、郑58和农系273)为受体,同时构建含植酸酶基因的表达载体,并利用除草剂作为筛选标记。通过超声波介导花粉转化技术,将外源植酸酶基因导入受体材料基因组中,后代材料经过筛选和分子检测,获得了植酸酶转基因玉米新材料。主要研究结果如下:1、成功构建遗传转化的表达载体。以pCAMBIA3300为骨架载体,将植酸酶基因phy替代GUS基因,构建表达载体,其中启动子替换为适合玉米转化的ubi。酶切验证表明载体构建成功。2、蔗糖溶液浓度筛选优化。将五种玉米品系受体材料花粉粒放置在不同浓度的蔗糖溶液中进行筛选,以花粉粒正常萌发为判断标准。结果表明,当蔗糖浓度为15%时,五种玉米材料花粉粒的萌发效率最好,而其他浓度的蔗糖溶液则不能萌发或者萌发效果差,甚至发生破裂。3、抗性材料的获得。转化后代材料用浓度为600ppm的除草剂草丁膦进行筛选,获得了具有抗性的转基因材料。4、PCR检测结果表明,外源目的基因phy和除草剂筛选标记基因bar均已经整合到玉米基因组当中。RT-PCR结果表明,外源目的基因phy出现明显扩增条带,表明phy基因至少在转录水平上有效表达。5、除草剂筛选基因bar试纸条检测结果表明,部分转基因植株呈现阳性,说明此外源基因在蛋白水平上有效表达。由此说明,超声波介导花粉转化法可以将外源基因导入玉米并进一步整合到细胞核基因组当中,是一种简便易行、快速有效和成本较低的遗传操作技术,将为今后玉米规模化遗传转化和其它相关植物的转基因新技术研究开辟了新途径。
中文摘要 | 第4-6页 |
Abstract | 第6-7页 |
目录 | 第8-11页 |
第一章 文献综述 | 第11-29页 |
1.1 前言 | 第11-13页 |
1.2 植酸酶的概述 | 第13-18页 |
1.2.1 植酸的发现 | 第13-14页 |
1.2.2 植酸在畜牧生产中的危害 | 第14-15页 |
1.2.3 植酸酶的基本特性及生物功能 | 第15-16页 |
1.2.4 植酸酶的来源 | 第16-17页 |
1.2.5 植酸酶在饲料工业中的应用 | 第17-18页 |
1.3 转植酸酶基因玉米的研究现状 | 第18-19页 |
1.4 植物遗传转化方法 | 第19-26页 |
1.4.1 基因枪法 | 第20-21页 |
1.4.2 农杆菌介导法 | 第21-22页 |
1.4.3 PEG 法 | 第22-23页 |
1.4.4 显微注射法 | 第23页 |
1.4.5 电击法和激光法 | 第23-24页 |
1.4.6 花粉管通道法 | 第24-25页 |
1.4.7 超声波介导花粉法 | 第25-26页 |
1.5 转基因植物与抗除草剂基因的筛选 | 第26-27页 |
1.6 本研究的目的与意义 | 第27-29页 |
第二章 实验材料与方法 | 第29-43页 |
2.1 实验材料 | 第29-30页 |
2.1.1 供试植物材料 | 第29页 |
2.1.2 质粒载体 | 第29-30页 |
2.1.3 试剂及试剂盒 | 第30页 |
2.1.4 实验仪器 | 第30页 |
2.2 质粒提取 | 第30-32页 |
2.2.1 提取步骤 | 第30-32页 |
2.2.2 纯度和浓度的确定 | 第32页 |
2.3 酶切体系 | 第32-33页 |
2.4 琼脂糖凝胶目的片段回收 | 第33-34页 |
2.5 超声波介导花粉进行玉米转化的方法 | 第34-36页 |
2.5.1 预备实验 | 第34-36页 |
2.5.1.1 花粉采集和悬浮液浓度的测定 | 第34-35页 |
2.5.1.2 超声波介导的参数选择 | 第35-36页 |
2.5.2 花粉的转化与授粉 | 第36页 |
2.6 玉米植株叶片的总 DNA 提取 | 第36-38页 |
2.6.1 试剂配制 | 第36-37页 |
2.6.2 提取步骤 | 第37-38页 |
2.7 提取玉米叶片总 RNA | 第38-39页 |
2.7.1 提取总 RNA 方法 | 第38-39页 |
2.7.2 RT-PCR | 第39页 |
2.8 转基因玉米的检测 | 第39-43页 |
2.8.1 除草剂喷洒实验 | 第39-40页 |
2.8.2 除草剂试纸条检测 | 第40-41页 |
2.8.3 bar 基因和 phy 基因的 PCR 检测 | 第41-42页 |
2.8.4 phy 基因的 RT-PCR 检测 | 第42-43页 |
第三章 结果与分析 | 第43-54页 |
3.1 载体改造 | 第43-45页 |
3.2 超声波介导花粉转化玉米 | 第45-48页 |
3.2.1 花粉萌发实验:蔗糖溶液浓度的选择 | 第45-46页 |
3.2.2 种子的结实情况 | 第46-48页 |
3.3 转基因玉米检测 | 第48-54页 |
3.3.1 除草剂喷洒实验 | 第48-49页 |
3.3.2 除草剂试纸条检测 | 第49-50页 |
3.3.3 bar 基因和 phy 基因的 PCR 检测 | 第50-52页 |
3.3.4 phy 基因的 RT-PCR 检测 | 第52-54页 |
第四章 结论 | 第54-55页 |
第五章 讨论 | 第55-61页 |
5.1 关于花粉介导花粉转化 | 第55-56页 |
5.2 超声波介导花粉转化法的优势 | 第56-57页 |
5.3 进一步需要论证的问题 | 第57-58页 |
5.4 玉米花粉介导法转基因成活率、成株率、转化率提高的相应对策 | 第58-59页 |
5.5 展望 | 第59-61页 |
5.5.1 超声波介导花粉转化技术应用展望 | 第59-60页 |
5.5.2 利用转基因玉米生产植酸酶的前景 | 第60-61页 |
参考文献 | 第61-70页 |
作者简介及科研成果 | 第70-71页 |
致谢 | 第71页 |
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