背景：近年来,全球糖尿病的发病率显著提高,糖尿病是心血管疾病的独立危险因子,而心血管疾病又是糖尿病病人致死致残的主要原因之一。糖尿病增加心血管疾病危险性的具体机制目前尚不清楚,但心肌胰岛素抵抗及葡萄糖代谢紊乱是糖尿病心肌病变的共同特征和主要发病机制。因此,探讨心肌葡萄糖代谢的具体分子机制迫在眉睫。肥胖的糖尿病患者常常伴有胰岛素抵抗。而富含游离脂肪酸的高脂饮食是导致胰岛素抵抗的重要危险因素之一。近来的研究证实,脂代谢紊乱既是胰岛素抵抗的原因,又是胰岛素抵抗的结果。随着生活水平的提高,全世界肥胖患者的发病率日益增多,其中高脂、低碳水化合物饮食是其常见的原因之一。研究发现,高脂、低碳水化合物饮食可导致心肌能量代谢紊乱,然而其具体分子机制尚不清楚。AMP活化的蛋白激酶(AMPK)可以调节心肌葡萄糖的利用及能量平衡。AMPK可被其上游激酶LKB1激活,进而激活其下游靶蛋白,例女(?)PPAR γ辅激活因子1α(PGC-1α),磷酸果糖激酶2(PFK-2)等,并可促进葡萄糖转运子(GLUT1,GLUT4)的转位,从而调节葡萄糖的转运和摄取。有研究报道,高脂、低碳水化合物饮食13周显著影响大鼠脂肪细胞及骨骼肌细胞的糖代谢和胰岛素敏感性。近年来的报道也表明,高脂、低碳水化合物饮食与心脏功能异常及能量代谢紊乱密切相关。高脂、低碳水化合物饮食60天可降低附睾脂肪组织中AMPK的磷酸化和活性,以及骨骼肌PGC-1a的表达。此外,AMPK介导的PFK2活化可能参与心肌缺血糖原分解的激活过程。然而,高脂、低碳水化合物饮食对心肌功能及相关分子机制的研究却很少。因此,我们给予大鼠不同的饮食结构,然后研究高脂、低碳水化合物对心脏功能、心肌AMPK活性,以及对LKB1、AMPK、PGC-1α和PFK-2蛋白表达的影响。目的：本研究观察了正常饮食及高脂、低碳水化合物饮食对心脏功能、心肌AMPK活性,以及LKB1、AMPK、PGC-1α和PFK-2蛋白表达的影响；并进一步阐述了高脂、低碳水化合物饮食影响心肌功能及代谢紊乱的可能机制。具体探讨了以下问题：1.观察高脂、低碳水化合物饮食对糖脂代谢及心脏功能的影响。2.观察高脂、低碳水化合物饮食对心肌组织中AMPK活性的影响。3.观察高脂、低碳水化合物饮食对心肌组织中LKB1、AMPK、PGC-1α和(?)PFK-2蛋白表达的影响。方法：1.动物分组及喂养：雄性Wistar大鼠24只(4周,160-180g),随机分为2组,每组12只,即实验组和对照组,在同等热量的情况下,分别给予高脂、低碳水化合物饮食(59%脂肪,24%碳水化合物及17%蛋白质)及对照组饮食(10%脂肪,70%碳水化合物及20%蛋白质),喂养时间为22周,每周记录体重、食物及水量。2.高脂、低碳水化合物饮食对糖脂代谢及心脏功能的影响：处死之前抽取空腹血,检测空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)。采用经胸超声心动图测量左心室收缩末期直径(LVESD),舒张末期直径(EDD),收缩期室间隔壁厚度(IVSS),舒张期室间隔厚度(IVSD),收缩期后壁厚度(PS),和舒张期后壁厚度(PD)。3.高脂、低碳水化合物饮食对心肌组织中AMPK活性的影响：称量大鼠左心室组织并采用放射性32P测量AMPK的活性。4.高脂、低碳水化合物饮食对心肌组织中LKB1、AMPK、PGC-1α和PFK-2表达的影响：RT-PCR检测心肌组织中AMPK催化亚基AMPK α1和α2的mRNA水平。Western blot检测(?)Total-LKBl, Phospho-LKB1(Ser431), AMPK α, Phospho-AMPK α(Thr172),PGC-1α以及Phospho-PFK-2(ser466)的蛋白表达水平。结果：1.观察高脂、低碳水化合物饮食对糖脂代谢及心脏功能的影响：1.1高脂、低碳水化合物饮食对糖脂代谢的影响：实验前两组大鼠的体重无明显差异(实验组：209.50±13.77g,对照组：210.25±12.10g(P>0.05)),高脂、低碳水化合物喂养22周后,实验组大鼠的体重比对照组增加了13.2%(P<0.01)。实验组大鼠的空腹血糖升高了28.1%(P>0.05),但未达到统计学意义。高脂、低碳水化合物饮食显著升高了空腹胰岛素水平(29.3%,P<0.05),这表明实验组大鼠出现了胰岛素抵抗。同时,与对照组相比,实验组大鼠的血清总胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯分别增加了15.0%(P>0.05),38.7%(P<0.01),33.5%(P<0.01)。1.2高脂、低碳水化合物饮食对心脏功能的影响：两组大鼠实验前左心室的各项参数无明显差异,然而高脂、低碳水化合物饮食喂养22周后,与对照组相比,实验组的左心室收缩末期直径(ESD)及收缩期室间隔壁厚度(IVSS)明显增加,然而舒张末期直径(EDD),舒张期室间隔厚度(IVSD),收缩期后壁厚度(PS)和舒张期后壁厚度(PD)无明显变化。实验组大鼠的缩短分数(FS%)和射血分数(EF%)也相应的降低。2.高脂、低碳水化合物饮食降低心肌组织中AMPK活性及表达：在高脂、低碳水化合物饮食喂养22周的实验组大鼠中,心肌AMPK α1(?)口AMPKα2的活性被明显抑制。与对照组相比,实验组大鼠的AMPK α1和(?)AMPK α2基因表达分别下降了43.33%(P<0.05),27.52%(P<0.05)；同时实验组大鼠总的AMPKα蛋白水平及磷酸化AMPK α的蛋白水平也明显降低,分别降低了54.47%(P<0.05),58.76%(P<0.05)。然而,两组磷酸化AMPK a与总AMPK α蛋白水平的比值无显著统计学意义。3.高脂、低碳水化合物饮食对心肌组织中LKB1、PGC-1α和PFK-2表达的影响：实验组及对照组大鼠心肌组织中总的LKB1蛋白水平无明显差异,然而,与对照组相比,实验组大鼠心肌组织的磷酸化LKB1显著降低了59.09%(P<0.05)。实验组大鼠心肌组织的PGC-1α及磷酸化PFK-2的蛋白表达水平均显著下降。结论：1、高脂、低碳水化合物饮食增加了实验组大鼠的体重,空腹胰岛素水平,以及血清总胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯水平。高脂、低碳水化合物饮食致使大鼠心肌收缩功能受损。2、高脂、低碳水化合物饮食显著减低心肌组织中AMPK活性,并降低AMPK的基因和蛋白表达水平。3、高脂、低碳水化合物饮食下调大鼠心肌组织中LKB1、AMPK、PGC-1α、PFK-2的蛋白表达水平。调节心肌葡萄糖转运的具体信号机制仍未完全明确。蔗糖非发酵AMPK相关激酶(SNARK)是AMPK相关蛋白之一,目前已证实其可在心脏中表达,并且参与调节小鼠骨骼肌收缩刺激的葡萄糖代谢。为了研究心肌组织中SNARK的功能,我们首先研究了SNARK的苏氨酸208磷酸化位点,因为此位点是SNARK活性的关键位点。动物实验包括运动实验、缺血实验及胰岛素实验三部分。运动实验中,24只小鼠被分成四组,对照组(静息状态下)、运动10分钟组、运动30分钟组、运动60分钟组,运动组小鼠分别在坡度为12.5%的跑步机上以0.6英里/小时的速度运动10、30、60分钟,然后将其麻醉取出心脏并储存在液氮中。缺血实验分为缺血组和对照组,缺血组小鼠脱臼处死3分钟后取出心脏,对照组处死后原位立即冰冻心脏。胰岛素实验分为对照组、次大剂量胰岛素组(葡萄糖刺激的生理剂量胰岛素释放)及大剂量胰岛素组。次大剂量胰岛素组及大剂量胰岛素组分别腹腔注射1g/kg的葡萄糖及1u/kg的胰岛素,十分钟后取出心脏并储存在液氮中。我们的结果显示,跑步运动可以轻微但有统计学意义的增加了SNARK苏氨酸208位点的磷酸化水平。缺血同样可以增力(?)SNARK苏氨酸208位点的磷酸化水平,但是生理剂量的胰岛素及大剂量的胰岛素对SNARK苏氨酸208位点的磷酸化水平无影响。其次,我们应用HL1心肌细胞来进一步研究SNARK的功能。首先我们过表达野生型SNARK(2倍),或者应用shRNA基因敲除HL1心肌细胞内源性SNARK(50-60%)。然后,我们分别将过表达及基因敲除SNARK的HLl细胞给予缺血刺激(充满N2的酸性溶液,作用45分钟)或者胰岛素刺激(100nM的胰岛素,作用20分钟),最后测量心肌细胞的葡萄糖摄取及糖原含量。我们发现过表达野生型SNARK显著增加了基础状态下心肌细胞的葡萄糖转运及糖原含量。但是过表达野生型SNARK并未进一步影响缺血刺激所致的葡萄糖转运及糖原含量。然而,基因敲除SNARK显著降低了缺血刺激的葡萄糖转运。过表达野生型SNARK或者基因敲除SNARK均未改变胰岛素刺激的葡萄糖转运或糖原含量。最后,为了进一步研究SNARK在体内的功能,我们在运动跑步机上训练杂合子SNARK基因敲除小鼠及野生型小鼠,使其以0.6英里／小时的速度在12.5%的斜坡上运动30分钟,并分别测量小鼠心肌组织的葡萄糖摄取。在杂合子SNARK基因敲除小鼠心脏中,运动刺激的葡萄糖摄取比野生型小鼠降低了50%。综上所述,运动和缺血刺激增加小鼠心脏SNARK苏氨酸208位点的磷酸化水平,并且SNARK调节运动及缺血刺激的葡萄糖转运。因此SNARK是重要的心脏中非胰岛素依赖的葡萄糖转运调节因子。
