蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)是鳞翅目大蚕蛾科的一种泌丝昆虫,既是重要的经济昆虫,同时也是优良的分子遗传研究生物。对蓖麻蚕内参基因的筛选、蓖麻蚕乙酰胆碱酯酶基因(Pcrace1)的克隆和蓖麻蚕对辛硫磷农药抗性的研究,为今后从分子水平上阐明蓖麻蚕的代谢途径,研究有关蓖麻蚕的经济性状、生长发育调节和重要的抗病基因奠定重要的基础,同时对开展蓖麻蚕抗药性研究,减少蚕业生产中的农药中毒具有一定的的实用意义。1、蓖麻蚕基因转录表达分析的内参基因筛选分别对蓖麻蚕的4个组织及9个不同发育时期的个体材料进行实时荧光定量PCR,制作标准曲线,采用相对定量的方法处理Ct值,结合NormFinder和geNorm软件分析4个候选内参基因肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、18SrRNA和16SrRNA在蓖麻蚕不同组织和不同发育时期转录表达的稳定性。结果表明肌动蛋白基因在蓖麻蚕血液、脂肪体、中肠、丝腺各组织以及蓖麻蚕幼虫、蛹、成虫、卵各发育时期的表达最为稳定,适合作为蓖麻蚕基因转录研究的内参基因。2、蓖麻蚕乙酰胆碱酯酶基因(Pcrace1)cDNA片段的克隆和表达分析利用RT-PCR和RACE技术从蓖麻蚕幼虫头部组织克隆了乙酰胆碱酯酶基因(Pcrace1),克隆的cDNA片段长度为2374bp,开放阅读框(ORF)的长度是2067bp,5’端和3’端分别含有207bp和100bp的非翻译区,编码688个氨基酸残基,编码的蛋白质的相对分子量为77.7kD,等电点为6.275。基于乙酰胆碱酯酶同源氨基酸序列的系统分析表明,蓖麻蚕与小卷蛾的亲缘关系最近。蓖麻蚕Pcrace1基因在5龄第三天幼虫的头部、脂肪体、血液均有表达,以头部表达量最高。不同发育时期以5龄表达量最高,1龄表达量最低。3、蓖麻蚕对辛硫磷农药抗性研究将40%的辛硫磷原液稀释成35mg/L~70 mg/L浓度区间的8个浓度梯度,采用浸叶法测定了辛硫磷对于5龄第3天蓖麻蚕24h的LC50,蓖麻蚕对40%辛硫磷乳油的LC50(24h)为51.81mg/L。利用实时荧光定量PCR方法检测添食50 mg/L辛硫磷后Pcrace1和Pcrace2在血液、脂肪体、中肠、丝腺、头部等不同组织中的表达变化,结果表明在添食辛硫磷之后,Pcrace1和Pcrace2在各组织中的表达都有变化,其中Pcrace1在头部和脂肪体的转录表达变化量分别比对照组上调10.66倍和26.50倍;Pcrace2在头部和脂肪体的转录表达变化量分别比对照组上调24.73倍和14.56倍;Pcrace1和Pcrace2在中肠和丝腺中的转录表达变化不大,Pcrace1和Pcrace2在血液中几乎无表达变化。结果表明Pcrace1和Pcrace2主要在脂肪体和头部发挥代谢解毒作用,而中肠和丝腺等组织对农药辛硫磷的代谢解毒作用较小,血液几乎不参与解毒作用。
