第一部分原代大鼠肝细胞分离及培养鉴定目的建立一种相对简易的原代大鼠肝细胞分离及培养方法,并对肝细胞纯度及生物活性进行鉴定。方法原代大鼠肝细胞经改良原位非循环两步灌流法及多次过滤低速离心法分离后,再用常规DMEM高糖培养基继续培养；采用锥虫蓝拒染法检测接种瞬时肝细胞的存活率,在倒置显微镜下观察肝细胞形态变化。通过过碘酸-Schiff反应(PAS)来检测肝细胞糖原合成及储备能力：利用免疫细胞化学法检测肝细胞角蛋白18(CK-18)的表达；联合两者判断肝细胞纯度。结果每只SD大鼠可以获1.38*108~1.74*108个肝细胞,肝细胞活性在接种瞬时大于90%。倒置显微镜下可观察到接种后4h肝细胞基本贴壁,贴壁后肝细胞胞体变平变大,随后邻近的肝细胞相互靠拢形成岛状或条索状结构。肝细胞内糖原经PAS染色后被染成红色颗粒状或者片状。CK-18经抗CK-18免疫细胞化学染色后呈棕黄色均匀分布于肝细胞内。通过PAS染色及抗CK-18免疫细胞化学染色后联合鉴定肝细胞纯度在95%左右。结论通过改良原位两步非循环灌注法及多次过滤低速离心法成功分离并培养原代大鼠肝细胞,该方法相对容易操作,所培养肝细胞数量、活力和纯度较高,可在具备普通细胞培养条件的实验室推广应用。第二部分追赶生长IUGR大鼠肝细胞SOCS3和胰岛素受体后转导通路分子表达变化目的研究追赶生长宫内发育迟缓(CG-IUGR)大鼠肝细胞中细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)和胰岛素受体后信号转导途径中关键分子胰岛素受体底物1(IRS1)、胰岛素受体底物2(IRS2)、磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)、蛋白激酶Akt2以及糖异生途径关键酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的表达变化,初步探讨追赶生长IUGR大鼠胰岛素抵抗的发生机制。方法采用孕期全程限食以及缩减每窝仔鼠数量的方法建立CG-IUGR大鼠模型；评价追赶生长宫内发育迟缓大鼠糖脂代谢状态；运用改良原位两步非循环灌流法分离并培养原代大鼠肝细胞；采用实时定量PCR (RT-PCR)和Western blot检测胰岛素抵抗CG-IUGR大鼠肝细胞于基础状态和胰岛素刺激状态下SOCS3、IRS1、IRS2和PI3K在mRNA和蛋白水平表达变化并评估胰岛素刺激前后Akt2磷酸化水平以及糖异生关键酶在转录水平的表达变化。结果CG-IUGR大鼠肝细胞在基础状态和胰岛素刺激状态下,SOCS3在mRNA和蛋白水平表达量均较正常对照组高(P<0.05)；IRS1和PI3K在mRNA和蛋白水平表达量均较正常对照组低(P<0.05),而IRS2在mRNA和蛋白水平表达量与正常对照组相比无明显差异(P<0.05)；磷酸化Akt2表达水平均较正常对照组降低。胰岛素刺激后对PEPCK和G6Pase转录水平的抑制作用在CG-IUGR大鼠肝细胞较正常大鼠细胞降低。结论CG-IUGR大鼠肝细胞中SOCS3表达量增加,通过负性调节下调IRS1的表达且下游的分子活化水平随之降低；CG-IUGR肝细胞糖异生关键酶转录水平增高意味着胰岛素敏感性降低且肝糖生成增多,这可能是CG-IUGR大鼠发生以胰岛素抵抗为核心的疾病分子机制之一。第三部分SOCS3表达下调对追赶生长IUGR肝细胞胰岛素受体后信号转导及糖代谢的影响目的探讨转录水平下调SOCS3表达对追赶生长宫内发育迟缓大鼠(CG-IUGR)胰岛素受体后信号转导通路关键分子表达变化以及葡糖糖代谢的影响。方法运用孕期全程限食以及缩减每窝仔鼠数量的方法建立追赶生长宫内发育迟缓大鼠模型；大鼠肝细胞采用改良原位两步非循环灌流法分离并培养；以脂质体为载体将针对大鼠SOCS3基因设计的特异性siRNA分子(siSOCS3)转染至CG-IUGR大鼠肝细胞中,采用实时定量PCR (RT-PCR)和Western blot筛选出最有效干扰分子；干扰后48h,检测CG-IUGR大鼠肝细胞于基础状态和胰岛素刺激状态下IRS1、PI3K蛋白水平和Akt2磷酸化水平表达变化并用RT-PCR评估干扰后对糖异生关键酶转录水平表达的影响。结果干扰后48h, CG-IUGR大鼠肝细胞在基础状态和胰岛素刺激状态下,IRS1和PI3K蛋白水平表达量均较干扰前高(P<0.05)；磷酸化Akt2表达水平均较干扰前增高。基础状态下,CG-IUGR大鼠肝细胞PEPCK和G6Pase转录水平于干扰后较干扰前降低,但差异不具有统计学意义(P<0.05)；胰岛素刺激后,CG-IUGR大鼠肝细胞PEPCK和G6Pase表达干扰后较干扰前显著降低(P<0.05)。结论siSOCS3能有效下调SOCS3的表达,从而通过增加胰岛素受体后信号通路分子的表达改善CG-IUGR大鼠肝细胞胰岛素敏感性,且通过降低糖异生关键酶的基因表达改善肝细胞葡萄糖代谢状态,可能成为以胰岛素抵抗为核心的疾病治疗靶点。
