hMSCs与Col及Col-HA支架体外复合构建软骨及软骨下骨的研究

骨组织工程论文 骨髓基质干细胞论文 生物支架材料论文 软骨修复论文
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关节软骨以及软骨下骨的损伤是骨科临床的常见疾病。临床对关节软骨损伤治疗的手段不少,但效果都不太理想。研究表明,骨髓基质干细胞作为一种具有多向分化潜能的干细胞,在适当的条件下可以被诱导分化成为软骨细胞和成骨细胞。本实验主要利用骨髓基质干细胞的这一特性,对其进行成软骨和成骨诱导,建立诱导和鉴定体系;并在这基础上,把骨髓基质干细胞与生物支架材料复合培养,在体外构建工程软骨和软骨下骨修复体。本研究主要成果如下:(1)从人骨髓中成功分离出长梭形、漩涡状分布的贴壁细胞,并通过流式细胞术证明分离并纯化得到的贴壁细胞确实是人骨髓基质干细胞hMSCs。(2)分离得到的hMSCs在成软骨诱导液的培养条件下高密度培养,得到直径约为0.5 mm的细胞微团。通过阿辛蓝染色、II型胶原的免疫组织化学染色、糖胺聚糖定量qRT-PCR等方法,从组织化学和分子生物学的层面对诱导结果进行检测和验证,最终建立了hMSCs成软骨的诱导和鉴定体系。(3)分离得到的hMSCs使用成骨诱导液进行单层培养,对成骨诱导21天的细胞进行碱性磷酸酶ALP染色、茜素红染色和I型胶原的免疫组织化学染色、碱性磷酸酶定量和qRT-PCR等,在组织化学和分子生物学的水平上对诱导结果进行检测和验证,最后成功的建立了hMSCs成骨的诱导和鉴定体系。(4)把得到的hMSCs接种到生物支架材料上。利用前文建立的成软骨诱导和鉴定体系,对COL和COL-HA两种生物支架材料进行比较。结果显示,COL生物支架材料相对于COL-HA生物支架材料更适合用于软骨缺损的修复。把得到的hMSCs接种到生物支架材料上。利用前文建立成骨诱导和鉴定体系,对COL和COL-HA两种生物支架材料的成骨特性进行比较。比较结果显示,COL-HA生物支架材料相对于COL生物支架材料更适合用于软骨下骨或骨组织缺损的修复。
摘要第6-7页
Abstract第7-8页
第一章 绪论第12-21页
    1.1 引言第12页
    1.2 软骨、骨组织的细胞生理学第12-14页
        1.2.1 软骨与软骨细胞第12-13页
        1.2.2 骨细胞与成骨化第13-14页
    1.3 骨组织再生工程第14-16页
        1.3.1 骨、软骨再生的临床需要第14页
        1.3.2 MSCs 在软骨修复工程中的应用第14-16页
        1.3.3 MSCs 在骨修复工程中的应用第16页
    1.4 生物支架材料第16-19页
        1.4.1 软骨修复中的生物支架材料第16-18页
        1.4.2 骨修复中的生物支架材料第18-19页
    1.5 本实验研究背景及研究意义第19页
    1.6 本课题的主要研究内容第19-21页
第二章 人骨髓间充质干细胞的分离纯化及鉴定第21-26页
    2.1 引言第21页
    2.2 实验仪器与试剂第21-22页
        2.2.1 实验仪器与耗材第21页
        2.2.2 实验试剂第21-22页
    2.3 实验方法和步骤第22-23页
        2.3.1 hMSCs 的分离培养第22-23页
        2.3.2 流式细胞术鉴定hMSCs 表面标志第23页
    2.4 实验结果第23-24页
        2.4.1 hMSCs 的分离培养第23-24页
        2.4.2 流式细胞术鉴定hMSCs 的表面标志第24页
    2.5 分析和讨论第24-25页
    2.6 本章小结第25-26页
第三章 hMSCs 成软骨、成骨诱导体系的建立第26-47页
    3.1 引言第26页
    3.2 实验仪器与试剂第26-30页
        3.2.1 实验仪器与耗材第26-27页
        3.2.2 实验试剂第27-30页
    3.3 实验方法和步骤第30-36页
        3.3.1 hMSCs 成软骨诱导第30页
        3.3.2 石蜡包埋切片第30页
        3.3.3 阿辛蓝染色鉴定hMSCs 的成软骨诱导第30页
        3.3.4 II 型胶原免疫组织化学染色鉴定hMSCs 的成软骨诱导第30-31页
        3.3.5 糖胺聚糖(GAGs)定量第31页
        3.3.6 实时定量PCR 检测成软骨相关基因的表达第31-33页
        3.3.7 hMSCs 成骨诱导第33页
        3.3.8 碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定hMSCs 成骨诱导第33页
        3.3.9 茜素红染色鉴定hMSCs 成骨诱导第33页
        3.3.10 I 型胶原免疫组织化学染色鉴定hMSCs 成骨诱导第33页
        3.3.11 细胞总蛋白的提取第33-34页
        3.3.12 碱性磷酸酶(ALP)定量第34页
        3.3.13 总蛋白定量第34页
        3.3.14 实时定量PCR 检测成骨相关基因的表达第34-36页
        3.3.15 统计学处理第36页
    3.4 实验结果第36-42页
        3.4.1 hMSCs 成软骨诱导第36页
        3.4.2 阿辛蓝染色鉴定hMSCs 成软骨诱导第36-37页
        3.4.3 II 型胶原免疫组织化学染色鉴定hMSCs 成软骨诱导第37页
        3.4.4 糖胺聚糖(GAGs)定量第37-38页
        3.4.5 成软骨相关基因的表达第38-39页
        3.4.6 hMSCs 成骨诱导第39-40页
        3.4.7 碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定hMSCs 成骨诱导第40页
        3.4.8 茜素红S 染色鉴定hMSCs 成骨诱导第40页
        3.4.9 I 型胶原免疫组织化学鉴定hMSCs 成骨诱导第40-41页
        3.4.10 碱性磷酸酶(ALP)定量鉴定hMSCs 成骨诱导第41-42页
        3.4.11 成骨相关基因的表达第42页
    3.5 分析和讨论第42-45页
    3.6 本章小结第45-47页
第四章 hMSCs 与 Col 支架复合构建关节软骨的研究第47-62页
    4.1 引言第47页
    4.2 实验仪器与试剂第47-50页
        4.2.1 实验仪器与耗材第47-48页
        4.2.2 实验试剂第48-50页
    4.3 实验方法和步骤第50-54页
        4.3.1 hMSCs 与生物支架材料复合第50页
        4.3.2 MTT 法测定hMSCs 在生物支架材料上的增殖第50-51页
        4.3.3 hMSCs 在生物支架材料上的成软骨诱导第51页
        4.3.4 石蜡包埋与切片第51页
        4.3.5 阿辛蓝染色鉴定生物支架材料促成软骨诱导第51页
        4.3.6 II 型胶原免疫组织化学染色鉴定生物支架材料促成软骨诱导第51页
        4.3.7 糖胺聚糖定量第51-52页
        4.3.8 实时定量PCR 检测hMSCs 复合材料后成软骨相关基因的表达第52-53页
        4.3.9 统计学处理第53-54页
    4.4 实验结果第54-58页
        4.4.1 MTT 法测定hMSCs 在生物支架材料上的增殖第54页
        4.4.2 hMSCs 与生物支架材料复合成软骨诱导的石蜡切片染色第54-55页
        4.4.3 阿辛蓝染色鉴定生物支架材料促成软骨诱导第55-56页
        4.4.4 II 型胶原免疫组织化学染色鉴定生物支架材料促成软骨诱导第56-57页
        4.4.5 成软骨相关基因的表达第57-58页
    4.5 分析和讨论第58-60页
    4.6 本章小结第60-62页
第五章 hMSCs 与 Col-HA 支架复合构建软骨下骨的研究第62-76页
    5.1 引言第62页
    5.2 实验仪器与试剂第62-65页
    5.3 实验方法和步骤第65-69页
        5.3.1 hMSCs 在生物支架材料上的复合与成骨诱导第65页
        5.3.2 石蜡包埋与切片第65页
        5.3.3 碱性磷酸酶染色鉴定生物支架材料促成骨诱导第65-66页
        5.3.4 茜素红染色鉴定生物支架材料促成骨诱导第66页
        5.3.5 I 型胶原免疫组织化学染色鉴定生物支架材料促成骨诱导第66页
        5.3.6 hMSCs 复合生物支架材料总蛋白的提取第66页
        5.3.7 hMSCs 复合生物支架材料碱性磷酸酶定量第66页
        5.3.8 hMSCs 复合生物支架材料总蛋白定量第66页
        5.3.9 实时定量PCR 检测hMSCs 复合材料后成骨相关基因的表达第66-68页
        5.3.10 统计学处理第68-69页
    5.4 实验结果第69-73页
        5.4.1 hMSCs 与生物支架材料复合成软骨诱导的石蜡切片染色第69页
        5.4.2 碱性磷酸酶染色鉴定生物支架材料促成骨诱导第69-70页
        5.4.3 茜素红染色鉴定生物支架材料促成骨诱导第70-71页
        5.4.4 I 型胶原免疫组织化学染色鉴定生物支架材料促成骨诱导第71页
        5.4.5 碱性磷酸酶定量第71-72页
        5.4.6 hMSCs 复合材料后成骨相关基因的表达第72-73页
    5.5 分析和讨论第73-75页
    5.6 本章小结第75-76页
结论与展望第76-79页
参考文献第79-84页
攻读硕士学位期间取得的研究成果第84-85页
致谢第85页
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