miR27b通过靶向PPARγ调控脂肪在皮下脂肪细胞与肌内脂肪细胞中的差异沉积

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肌内脂肪含量是影响猪肉品质的重要因素。而育种过程中对高瘦肉率的长期选择,导致了肌内脂肪含量以及猪肉品质的下降。因此,提高肌内脂肪含量,同时不影响其它部位脂肪的沉积,特别是皮下脂肪,成为猪育种的一个重要目标。由于不同部位的脂肪在脂肪代谢与脂肪细胞分化能力上存在着差异,这为寻找调控脂肪在不同组织差异沉积的分子机理提供了可能性。为了解肌内脂肪与皮下脂肪差异沉积的机制,我们比较了源于皮下脂肪与肌内脂肪的前体脂肪细胞的分化能力,并对脂肪分化与沉积起关键调控作用的PPARy基因在两种细胞中的表达量进行了检测。随后预测了靶向PPARy的miRNA,并对其在两种细胞中的表达量进行了比较,最后通过双荧光报告系统对差异表达的miRNA进行靶向性验证。主要实验结果如下:1、在体外环境下,源于肌内脂肪组织的前体脂肪细胞在分化能力上强于皮下脂肪组织来源的前体脂肪细胞。DMI诱导分化9天后,肌内前体脂肪细胞脂质积聚水平显著高于皮下脂肪细胞(P<0.05)。对两种脂肪细胞中脂质代谢相关基因进行比较,结果表明,脂肪合成关键基因乙酰-CoA羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase, ACC)、脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase, FAS),以及脂肪降解相关基因脂肪甘油三酯脂酶(Adipose Triglyceride Lipase, ATGL)、激素敏感酯酶(Hormone Sensitive Lipase, HSL)在肌内脂肪细胞中的表达水平显著高于其在皮下脂肪细胞中的表达水平(P<0.05)。肌内脂肪细胞中脂肪细胞分化关键基因PPARy的mRNA表达及蛋白表达水平均显著高于其在皮下脂肪中的表达(P<0.05)。2、通过生物信息学预测获得miR-130a、miR-130b、miR128、miR-301、miR-27a和miR-27b等6个靶向PPARγ的miRNA。定量分析结果表明,miR-27a与miR-27b在皮下脂肪细胞的表达量显著高于肌内脂肪细胞中的表达量(P<0.05),而miR-130a、 miR-130b、miR128、miR-301的表达量在皮下脂肪细胞与肌内脂肪细胞中没有显著差异(P>0.05)。构建含PPARγ 3’-UTR序列的表达质粒pGL3-Control/PPARγ,荧光素酶活性分析表明,miR-27b可以靶向调控PPARγ。本研究表明,肌内前体脂肪细胞比皮下前体脂肪细胞在体外具有更强的分化能力。miR-27b能够靶向调控PPARγ, miR-27b在两种脂肪细胞中表达的差异能够导致PPARy在两种细胞中的表达差异,进而引起不同部位脂肪细胞分化能力的差异。
摘要第7-9页
ABSTRACT第9-10页
缩略词第11-12页
第一篇 文献综述第12-30页
    第一章 肌内脂肪的研究进展第12-24页
        1 肌内脂肪第12-18页
            1.1 肌内脂肪的成分第12页
            1.2 肌内脂肪的分布与发生发展第12-13页
            1.3 肌内脂肪的沉积第13-18页
        2 影响肌内脂肪的基因调控第18-21页
            2.1 影响脂肪沉寂的候选基因第18-21页
            2.2 对肌内脂肪沉积相关的信号转导通路的研究第21页
        3 肌内脂肪与其他部位脂肪的差异第21-24页
    第二章 miRNA与脂肪沉积的研究进展第24-30页
        1 miRNA概述第24-26页
        2 miRNA与siRNA的区别第26页
        3 miRNA与脂肪沉积的调控第26-28页
            3.1 miRNA与脂肪分化第26-27页
            3.2 miRNA与脂肪能量代谢第27页
            3.3 miRNA与肝脏脂类代谢第27-28页
            3.4 miRNA与胰岛素分泌第28页
        4 miRNA与脂肪分布第28-30页
第二篇 实验部分第30-52页
    第三章 皮下与肌内脂肪细胞分化能力及PPARγ表达水平的差异研究第30-42页
        1 实验仪器与试剂第30-32页
            1.1 主要仪器第30-31页
            1.2 主要试剂第31-32页
        2 实验方法第32-36页
            2.1 实验动物及样品采集第32页
            2.2 前体脂肪细胞复苏第32页
            2.3 细胞的传代培养与冻存第32-33页
            2.4 前体脂肪细胞诱导分化第33页
            2.5 油红O染色第33页
            2.6 RNA提取第33-36页
        3 实验结果第36-40页
            3.1 皮下脂肪前体细胞与肌内脂肪前体细胞分化能力的比较第36-38页
            3.2 PPAR7在成熟皮下脂肪细胞与肌内脂肪细胞中表达的差异第38-40页
        4 讨论第40-42页
    第四章 靶向PPAR7的miRNA鉴定及其在皮下与肌内脂肪细胞中的差异表达第42-52页
        1 实验仪器与试剂第42-43页
            1.1 主要仪器第42-43页
            1.2 主要试剂第43页
        2 实验方法第43-45页
            2.1 miRNA预测第43页
            2.2 miRNA的RT-qPCR第43页
            2.3 质粒构建第43-44页
            2.4 miRNA靶向性验证第44页
            2.5 miRNA与PPARγ3'-UTR的二级结构预测第44-45页
            2.6 数据统计第45页
        3 实验结果第45-48页
            3.1 预测的靶向PPARγ的miRNA第45页
            3.2 候选miRNA的筛选第45-46页
            3.3 候选miRNA的靶向性验证第46-47页
            3.4 RNA二级结构分析第47-48页
        4 讨论第48-52页
参考文献第52-62页
全文结论第62-64页
创新点第64-66页
致谢第66页
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