苦参毛状根及愈伤组织培养研究

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苦参(Sophora flavescens Ait.)为豆科(Leguminosae)槐属(Sophora Linn.)落叶灌木,是我国传统中药之一。主要分布在山西、陕西、北京、黑龙江、甘肃、河北、湖南、广西、四川等地。苦参具有清热燥湿、杀虫、利尿等功能。现代医学研究表明,苦参中的苦参碱和氧化苦参碱具有良好的抗癌活性,对黑色素瘤、膀胱癌、胃癌等均有不同程度的抑制作用,目前以苦参和其有效成分为原料开发了多种制剂并广泛用于临床。苦参生长周期需2-3年,加之苦参制剂的深度开发,苦参药材的市场需求量不断增加,其价格由2003的2.5元涨到2011的14元左右,在近几年内翻了4倍多,突显了苦参资源可持续发展的问题。本论文开展苦参毛状根培养体系研究,为解决苦参资源问题探索新途径。本论文研究了苦参毛状根的诱导、继代培养条件及苦参愈伤组织的诱导和增殖培养条件;并采用高效液相色谱分析法,对苦参毛状根及愈伤组织中苦参碱及氧化苦参碱含量进行了测定。研究结果如下:1.高效液相色谱法测定苦参碱及氧化苦参碱含量的色谱条件为:色谱柱:氨基柱(Hypersil NH24.6mm×250mm,5μm,柱号:E2021505,批号:9347);流动相:乙腈-无水乙醇-3%磷酸(84:8:8);检测波长:220nm;流速:1mL/min;进样量:15μL;柱温:室温。1)在所述条件下,苦参碱的保留时间为10.2min。苦参碱在10.0240.0μg/mL范围内,线性关系良好(r=0.9990),加样回收率为97.21%,RSD为1.75%。2)在所述条件下,氧化苦参碱的保留时间为15.9min。氧化苦参碱在10.0240.0μg/mL的范围内,线性关系良好(r=0.9995),加样回收率为99.12%,RSD为1.90%。2.苦参毛状根的最佳诱导条件为:以幼芽为外植体,在R1601菌液中添加100umol/L乙酰丁香酮,侵染20min,MS培养基,25±1℃暗培养2d。苦参毛状根的诱导率为28.6%。3.苦参毛状根继代培养条件:以改良的1/2MS为培养基,蔗糖为碳源,此条件下苦参毛状根生长较好。苦参毛状根中氧化苦参碱的富集量为1.79mg/g(苦参毛状根干重),未检测到苦参碱。4.苦参愈伤组织最佳诱导条件:以苦参幼芽为外植体,培养基MS+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L NAA中25±1℃条件下暗培养;以苦参幼芽、根、茎、叶片为外植体,其愈伤组织的诱导率分别为94.12%、74.19%、35.71%、23.08%。5.苦参愈伤组织最佳增殖条件:培养基MS+0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA,培养温度为25±1℃,黑暗培养;此条件下其增殖率为25.3%。不同激素组合对愈伤组织诱导率的影响不大,但对其增殖率的影响较大,其中激素NAA具有显著影响。对苦参愈伤组织中苦参碱及氧化苦参碱的研究表明,苦参愈伤组织中苦参碱的含量为0.40%,氧化苦参碱的含量4.34%。
摘要第5-7页
ABSTRACT第7-8页
缩写表第9-10页
目录第10-13页
1 绪论第13-25页
    1.1 药用植物苦参的概况第13-14页
        1.1.1 生物学特征第13-14页
        1.1.2 化学成分研究第14页
    1.2 苦参碱及氧化苦参碱的研究概述第14-18页
        1.2.1 苦参碱及氧化苦参碱的理化性质第14-15页
        1.2.2 苦参碱及氧化苦参碱的人工合成途径研究第15页
        1.2.3 苦参碱及氧化苦参碱的提取和含量测定第15-17页
        1.2.4 苦参碱及氧化苦参碱的药理作用第17-18页
        1.2.5 苦参碱及氧化苦参碱的制剂研究第18页
    1.3 药用植物毛状根的研究现状第18-22页
        1.3.1 药用植物毛状根诱导的影响因素第20-21页
        1.3.2 发根农杆菌转化毛状根的方法第21页
        1.3.3 植物毛状根的应用第21-22页
    1.4 植物组织培养的研究现状第22-24页
        1.4.1 植物组织培养生产次生代谢产物的优点第23页
        1.4.2 植物组织培养生产次生代谢产物的应用第23-24页
    1.5 本课题研究的目的与意义第24页
    1.6 本课题研究的主要内容第24-25页
        1.6.1 苦参毛状根诱导及培养条件的研究第24页
        1.6.2 苦参愈伤组织诱导及培养条件的研究第24-25页
2 苦参愈伤组织中苦参碱及氧化苦参碱分析方法学研究第25-33页
    2.1 试验材料与仪器设备第25-26页
        2.1.1 试验材料第25页
        2.1.2 主要试剂与设备第25-26页
    2.2 分析方法第26页
        2.2.1 苦参碱及氧化苦参碱的定性分析第26页
        2.2.2 苦参碱及氧化苦参碱的定量分析第26页
    2.3 研究内容与方法第26-27页
        2.3.1 薄层色谱法定性分析苦参碱及氧化苦参碱第26-27页
        2.3.2 高效液相色谱法定量分析苦参碱及氧化苦参碱第27页
    2.4 结果与分析第27-32页
        2.4.1 薄层色谱法定性分析苦参碱及氧化苦参碱第27-28页
        2.4.2 高效液相色谱法定量分析苦参碱及氧化苦参碱第28-32页
    2.5 小结第32-33页
3 苦参毛状根诱导及继代培养研究第33-42页
    3.1 试验材料与仪器设备第33-35页
        3.1.1 试验材料第33页
        3.1.2 试剂及仪器设备第33-35页
    3.2 分析方法第35页
        3.2.1 苦参毛状根诱导率统计第35页
        3.2.2 苦参毛状根生物量的测定第35页
        3.2.3 苦参毛状根中氧化苦参碱的含量测定第35页
    3.3 研究内容与方法第35-36页
        3.3.1 不同因素对苦参毛状根诱导率的影响第35-36页
        3.3.2 苦参毛状根的鉴别第36页
        3.3.3 苦参毛状根继代培养条件研究第36页
    3.4 结果与分析第36-41页
        3.4.1 不同因素对苦参毛状根诱导率的影响第36-38页
        3.4.2 苦参毛状根的鉴别第38-39页
        3.4.3 苦参毛状根继代培养条件研究第39-40页
        3.4.4 苦参毛状根中苦参碱及氧化苦参碱的检测第40-41页
    3.5 小结第41-42页
4 苦参愈伤组织诱导与继代培养研究第42-49页
    4.1 试验材料与仪器设备第42-43页
        4.1.1 试验材料第42页
        4.1.2 主要仪器及设备第42-43页
    4.2 分析方法第43页
        4.2.1 苦参愈伤组织生物量的测定第43页
        4.2.2 愈伤组织中苦参碱和氧化苦参碱的定性分析第43页
        4.2.4 愈伤组织中苦参碱和氧化苦参碱的定量分析第43页
    4.3 研究内容与方法第43-44页
        4.3.1 苦参愈伤组织诱导研究第43-44页
        4.3.2 苦参愈伤组织增殖继代培养研究第44页
    4.4 结果与分析第44-48页
        4.4.1 苦参愈伤组织诱导研究第44-46页
        4.4.2 愈伤组织的继代培养研究第46-47页
        4.4.3 苦参愈伤组织中苦参碱和氧化苦参碱的含量检测第47-48页
    4.5 小结第48-49页
5 结论与展望第49-51页
    5.1 结论第49页
    5.2 展望第49-51页
致谢第51-52页
参考文献第52-57页
附录 A:MS 培养基配方第57-58页
附录 B:改良 1/2MS 培养基配方第58-59页
攻读学位期间发表的学术论文目录第59-60页
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