中药吴茱萸道地性形成相关因子的研究

[目的]贵州铜仁地区产的吴茱萸,颗粒均匀、色泽绿、香气浓烈、味辛辣、品质上乘,饮誉中外。因贵州铜仁地区所产吴茱萸产量大、质量优良,被称为贵州道地药材,也为贵州名药之一；湖南新晃产吴莱萸质量最好,为吴茱萸道地药材。研究中药吴茱萸道地性形成的相关因子,探讨中药吴茱萸道地性形成的机制,构建吴茱萸道地药材产地适宜性分析评价的共性技术体系,结合社会经济条件,为因地制宜地进行生产区域布局和发展优势品种提供技术支撑,促进吴茱萸道地药材的可持续发展。[方法]通过网络调查了全国吴茱萸资源；实地考察了全国吴茱萸主要产区并对产区的种植品种、引种来源、蕴含量、经纬度、海拔、土壤类型等进行详细记录,采用五点采样法采集这些产区的根、茎、叶、果实和土壤等样品；利用TCMGIS技术对中药吴茱萸道地产区进行区划分析；用吴茱萸的嫩叶为试验材料,利用ITS、AFLP、SRAP等分子标记技术,对不同产地的吴茱萸进行遗传背景分析；采用平板分离法对湖南新晃、浏阳、湘乡、娄底,贵州铜仁,江西万载和浙江平阳、建德等地的吴茱萸内生真菌进行了分离纯化及比较分析,采用HPLC, LC-MS等分析技术对产吴茱萸碱、吴茱萸碱次碱及结构类似物等成分的微生物进行分析；采用HPLC对吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量进行测定,采用原子吸收法测定中药吴茱萸果实中微量元素的含量；采用滴定法测定土壤呼吸强度、采用最大或然计数法(MPN)进行微生物生理类群(钾细菌、氨化细菌、自生好氧固氮菌、硝化细菌、纤维素分解菌)的测定,采用比色法测定土壤酶脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶和蛋白酶等酶的活性,采用原子吸收法测定土壤微量元素的含量。[结果]1.文献查阅和实地考察发现,中药吴茱萸的道地性与纬度(27。左右)和海拔(200-600m)有关,说明纬度和海拔是中药吴茱萸道地性形成的关键因子；通过吴茱萸的生物学特性与产量的关系分析可以看出,吴茱萸品种的选择对吴茱萸的品质有很大的影响；通过TCMGIS的吴茱萸产地适宜性区划分析发现吴茱萸中的石虎品种82%的适宜产地在贵州,贵州作为石虎的道地产区与文献记载的完全吻合。2.ITS分析结果表明,吴茱萸药材ITS序列多态性较差,序列相似度大,仅部分样品存在少量碱基突变；AFLP分析结果表明,AFLP分子标记技术能很好地区分吴茱萸药材三个来源植物吴茱萸和石虎、疏毛吴茱萸之间的遗传差异；湖南新晃、贵州铜仁等高海拔山区作为中药吴茱萸道地产区,植株遗传背景比较稳定,这可能是生产质量稳定的药材原料的基础；SRAP分析结果表明,吴茱萸遗传背景多样性比较明显,由SRAP对吴茱萸的聚类分析可知,吴茱萸遗传背景有品种的差异,即石虎和疏毛吴茱萸的遗传差异较大,各地区有按同一品种聚类的趋势,同一品种不同产地的遗传背景差异较小,突出表现为贵州铜仁、湖南新晃道地产区的样品聚集较紧密。3.对不同产地同一品种、同一产地不同品种、同一产地同一品种的不同采收期的吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量检测表明,品种、产地、采收期对中药吴茱萸的道地性都有重要的影响。4.对不同吴茱萸产区的土壤因子研究表明,土壤Zn、土壤蔗糖酶活、土壤Cu等因子对中药吴茱萸道地性有显著影响。5.从8个吴茱萸产区共分离到31株内生真菌和37株内生细菌,分别从吴茱萸的叶、茎和果实中分离到不同的内生菌,表现为组织特异性,且在不同产地的内生菌的种类和优势种群存在明显的差异,即具有地域特异性；筛选出产吴茱萸碱和次碱及结构类似物的4株内生真菌和1株内生细菌。6.吴茱萸挥发油的抑菌试验表明,吴茱萸挥发油的抑菌能力可以作为中药吴茱萸道地性的一个重要的药效指标。[结论]中药吴茱萸道地性的形成主要是以下因子共同作用的结果：各产地吴茱萸栽培品种的差异、遗传背景的特异性等内在因素起决定性作用,如品质最好的湖南新晃的中药吴茱萸品种单一,全为石虎,其遗传背景差异小且稳定；环境因子中的温度,海拔和土壤微生物的总量和分布规律以及土壤元素的分布规律等外在因素起关键作用。研究吴茱萸道地性的技术包括：用于遗传背景分析的AFLP和SRAP等分子标记技术,用于道地产地区划的TCMGIS-Ⅱ系统分析法,用于土壤微生物的生理类群分析的最大或然法,用于土壤总微生物的含量测定的酸碱滴定法。