第一部分肝癌相关AFP和HNF1A基因单核苷酸多态性研究单核苷酸多态性(SNP)是基因组水平上的DNA多态性,可发生在基因编码区和非编码区,与疾病的发生发展密切相关。本研究在课题组前期原发性肝癌易感性基因系列研究基础上,重点聚焦AFP和HNF1A基因非编码区SNP位点多态性的研究,寻找这些位点与HCC易感性之间的关联,以及它们对基因转录的调控机制。我们通过聚合酶链反应-连接酶方法(Polymerase chain reaction–Ligation detection reaction,PCR-LDR)对来自中国汉族人群的1058例样本进行了SNP位点基因型检测。检测的SNP位点包括:AFP基因SNP位点rs6834059、rs4018和rs4024,以及HNF1A基因SNP位点rs73539。通过病例对照研究,评估了这些位点与HBV感染以及HBV相关HCC之间的关联性。然后,我们通过构建rs4024和rs735396位点野生型和突变型的荧光报告载体,初步研究了它们对基因转录活性的影响。我们通过体外EMSA实验进一步验证了它们对基因转录活性的影响。结果显示AFP的SNP位点rs6834059和rs4024基因多态性分别与HCC患者是否伴有肝硬化和TNM分期存在统计学相关。rs6834059位点G/G基因型在伴有肝硬化的HCC患者中比例更高(P=0.038,OR=2.72,95%CI:1.02-7.26),而rs4024位点G/G基因型在高TNM分期的HCC患者中比例更高(P=0.031,OR=1.88,95%CI:1.05-3.37)。此外,rs735396位点多态性与HBV相关HCC易感性之间存在显著相关性,携带A/A基因型人群具有更高的HCC患病风险(P=0.024,OR=1.55,95%CI:1.06–2.26)。荧光报告基因检测结果显示rs4204位点G/G基因型和rs735396位点G/G基因型具有更高的转录活性。此外,EMSA实验结果显示rs4204位点G/G与A/A基因型之间结合所在调控序列的核蛋白能力存在差异。结论:通过病例对照研究,我们发现了AFP基因SNP位点rs735396多态性与HCC的易感性显著相关,而AFP基因SNP位点rs6834059和rs4024多态性与HCC的进展显著相关。进一步功能学研究揭示了rs735396和rs4204位点多态性在基因转录中的调控作用。第二部分肝细胞癌与肝硬化基因表达谱差异分析肝硬化(Cirrhosis)是肝细胞癌(HCC)高危风险因素,易进展为HCC并最终导致死亡。本研究旨在比较HCC和Cirrhosis组织之间的基因表达数据,发现从Cirrhosis演变为HCC过程中的关键基因(Hub genes),以及这些基因在疾病过程中的作用。我们从高通量基因表达数据库(Gene expression Omnibus,GEO)下载了4个HCC和Cirrhosis相关数据集,并将HCC组织样本和正常肝组织样本数据合并为HCC数据集,将Cirrhosis组织样本数据定义为C数据集合。然后,我们使用WGCNA软件包构建了HCC和C数据集的权重基因共表达网络,获得显著共表达的基因模块,并通过flash Clust和dynamic Tree Cut软件包对得到的基因模块进行了分析,根据连接度计算筛选到出Hub基因。最后,应用DAVID在线数据库对模块特异性基因以及Yellow模块中Hub基因进行功能注释,并通过Cytoscape软件可视化显示功能注释网络。结果显示在排除了离群样本后,HCC数据集包含有394个HCC组织样本和29正常肝组织样本数据,C数据集包含215个肝硬化组织样本数据。HCC数据集构建了6个基因模块,分别标记为:蓝、棕、青绿、绿色、红色和黄色。其中的蓝、棕、青绿在HCC和C数据集之间具有高保守性,而黄色保守性最低。这些模块中的基因已经被发现与转录、有丝分裂、阳离子运输、阳离子稳态以及环化酶的分泌和调控有关。黄色基因模块中包含有编码细胞因子的基因,例如:CCL22和IL19,这些细胞因子可在HCC的发生过程中起到重要的作用。结论:通过HCC与Cirrhosis组织基因表达谱的WGCNA比较分析,发现了6个显著共表达的基因模块,其中一个基因模块可能与肝硬化进展为HCC紧密相关。通过Hub基因分析,我们发现了一些在肝硬化和肝细胞癌之间差异表达的基因,它们可能是HCC进展过程中发挥作用的重要因子。对这些基因进一步的功能研究,将有助于我们更好地了解HCC发病的分子机制。第三部分基于RNA-Seq的胆囊癌转录组研究胆囊癌是一种相对少见的的恶性肿瘤,具有高恶性程度、易早期转移、难于早期发现、对化疗药物不敏感等特点。本研究旨在通过对癌组织(TT)与癌旁组织(ANTT)之间差异表达基因(DEGs)的研究,发掘差异表达基因对胆囊癌形成和发展的影响机制,为寻找新的诊治靶点提供实验依据。首先,我们从本实验室前期研究的转录组测序(RNA-Seq)数据中挑选了16个DEGs。然后,通过实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR),在一个包含35例胆囊癌患者的独立样本中,对这些DEGs进行了验证。而且,我们结合临床随访信息,在差异表达基因与临床数据之间进行了关联性分析。结果显示其中有12个差异表达基因在验证组的表达数据与RNA-Seq数据一致。BIRC5、TK1、TNNT1和MMP9基因表达水平与胆囊癌手术后预后相关。BIRC5基因表达与TNM(tumor-node-metastasis)分期之间存在显著相关性。此外,我们还发现血清CA19-9检测值与TNNT1、MMP9和CLIC3基因表达水平之间有统计学相关性。生存分析结果显示,TK1和MMP9基因高表达的胆囊癌患者,伴有更差的临床预后。结论:通过对DEGs的研究,发现了一些与胆囊癌相关的重要DEGs。这些DEGs不仅具有成为胆囊癌诊断和预后相关生物学标记的潜力,而且为我们发现新的肿瘤治疗方法开拓了新思路。
