【研究背景】白细胞介素6(IL-6)是一种多功能细胞因子。研究发现:IL-6可能参与慢性前列腺炎的病理过程;同时在前列腺癌激素非依赖性形成以及神经内分泌化过程中,IL-6仍可能发挥着重要作用。然而在这两类疾病中,IL-6的具体作用机制仍不清楚。目前为止,仍缺乏在慢性前列腺炎中关于IL-6的分子流行病学研究;同时对于IL-6及其下游信号在前列腺癌发生发展过程中的作用及机制,仍需深入探索。【目的】1.针对Ⅲ型慢性前列腺炎,在蛋白质表达及基因多态性层面上,对IL-6进行分子流行病学调查;2.研究IL-6及下游JAK/STAT3信号途径对前列腺癌细胞系生物学行为的影响;3.在前列腺癌细胞系中,建立靶向沉默JAK/STAT3信号途径的RNA干涉体系;4.分析JAK/STAT3信号途径靶向沉默后,前列腺癌细胞系生物学行为的改变及可能机制。【方法】1.采用流行病学调查方法,选定IL-6分子流行病学研究的基线人群,结合环境因子及症状差异进一步建立分组研究队列;2.以初次的NIH-CPSI(National Institutes of Health chronic prostatitis symptom index,美国国立卫生研究院慢性前列腺炎症状评分)问卷调查及二次临床筛查为病例纳入方式,筛选Ⅲ型慢性前列腺炎患者并按亚型进一步分组,系统分析IL-6与症状、其他炎症因子及氧化应激水平的关系;3.酶联免疫吸附法测定血清及EPS(Expressed prostatic secretion,前列腺液)中IL-6等细胞因子水平,并分析炎症因子的相互关系;4.利用DCFH2-DA(2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酯,2′,7′-dichlorofluorescin diacetate)测定EPS中ROS(reactive oxygen species,活性氧)水平增长率,并分析ROS与IL-6水平的关系;5.采用ABTS (2,2’-Azinobis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt,2,2’-联氮双3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐)比色法测定EPS中TAOC(Total antioxidant capacity,总抗氧化能力)相对水平,并分析TAOC与IL-6水平的关系;6.四聚体ARMS-PCR(Amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,扩增受阻突变体系聚合酶链反应)检测IL-6分子启动子区-174G/C基因型,并分析与EPS中IL-6水平与症状的关系;7.分子生物学方法构建PSMA(Prostate specific membrane antigen,前列腺特异性膜抗原)特异性单链抗体融合蛋白并鉴定其活性;8.利用分子生物学软件,设计STAT3(Signal transducer and activator 3,信号转导和激活因子3)特异性siRNA(Small interfering RNA,小干扰RNA),并通过流式细胞仪分析及细胞ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附法)方法鉴定PSMA单链抗体融合蛋白对其的靶向递送能力;9.利用IL-6对前列腺癌LNCaP细胞系的双重生物学作用,建立IL-6处理的前列腺癌细胞系研究模型;10.利用STAT3的特异性siRNA处理LNCaP细胞,Western Blot方法检测相关STAT3分子的表达;11.利用MTT [3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide,噻唑蓝]方法描绘细胞进行生长曲线;12.采用PI(Propidium iodide,碘化丙啶)染色流式细胞术检测处理细胞的周期的变化,用Annexin V(膜联蛋白-V)/PI双染色流式细胞术检测凋亡。【结果】1. III型慢性前列腺炎IL-6分子流行病学研究1)各亚型CP/CPPS患者EPS中IL-6水平,较对照组均明显增高,但不伴有血清IL-6的变化。2)在IIIa亚型症状加重的病理过程中,IL-6与TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10共同参与其病理进程,并伴有氧化应激水平的增高及抗氧化能力的下降。3) IL-6参与IIIb亚型的病理进程,在IIIb亚型症状加重的过程中未发现TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10及氧化应激水平的明显变化。4)尽管对于CP/CPPS镜检分型标准的意义存在争议,但依据此标准的研究发现,IL-6在两型CP/CPPS中参与的病理机制可能不同。5) IL-6启动子-174 C/G基因型的CP/CPPS患者伴有较高水平的EPS-IL-6,同时其症状分值明显高于GG、CC纯合子患者。2.外源性IL-6对前列腺癌细胞系生物学行为的影响及其下游信号传导研究1)在外源性IL-6处理LNCaP细胞的初期,IL-6具有明显的促细胞凋亡,阻滞细胞周期及抑制增殖的作用。2)在IL-6抑制LNCaP细胞增殖阶段,同时也导致LNCaP细胞分泌PSA水平的增高。3)在IL-6诱导PSA的信号传导途径中,STAT3发挥了重要作用,因为STAT3被靶向沉默后,随着磷酸化STAT3的减少,PSA的分泌水平出现明显降低。4) STAT3并没有参与IL-6对LNCaP细胞增殖的抑制过程,因为在STAT3沉默后没有观察到IL-6处理LNCaP细胞生长曲线的变化,这表明:IL-6对LNCaP细胞的增殖抑制是通过其他信号传导途径来完成。【结论】1. IL-6参与III型慢性前列腺炎各亚型的病理过程,但由于各亚型病理机制的不同,IL-6发挥的作用机制可能不同;2.对于-174G/C基因型的III型慢性前列腺炎患者,其EPS中有较高水平的IL-6表达;3.外源性IL-6促进前列腺癌LNCaP细胞分泌PSA,JAK/STAT3信号通路参与IL-6促进LNCaP细胞恶性进展的过程。
