水稻是世界上最重要的粮食作物之一,而水稻生产受到诸多生物和非生物逆境胁迫。纹枯病为我国水稻三大病害之一,每年造成水稻产量的重大损失,部分地区甚至成为水稻病害之首。深入了解水稻抗病遗传机理,发现和利用抗病相关基因从而提高水稻的抗病性意义重大。本研究通过构建遗传群体、抗病性表型鉴定及分子标记作图,对水稻抗纹枯病QTLs定位；利用全基因组表达谱芯片筛选抗病基因,克隆了2个位于QTL定位区间的候选基因；构建了超表达载体并转化水稻,对抗病基因的分子功能进行了初步研究。研究的主要结果如下：1.利用来自中国广西的一个深水稻品种RSB03,与节水抗旱稻保持系沪旱1B(HH1B)杂交构建了包含286单株的F2群体及包含121个体的重组自交系(RILs)群体(F6：9),采用人工接种的方法对群体及亲本材料进行了抗病性鉴定,鉴定指标包括病级(DG)、病斑长(LL)、病斑高(LH)、相对病斑长(RLL)以及相对病斑高(RLH)等；2.2008年在上海(E1)和海南(E2)以及2009年在上海(E3)和海南(E4)分别对亲本及RILs群体进行表型鉴定,结果表明RSB03的抗病性显著优于HH1B。在四个环境中HH1B的DG、LL及RLL平均值分别为5.2、23.7cm及28.1%,而RSB03则平均为3.3、23.7cm和12.7%,其他几个抗病相关性状也表现同样特点,群体的表型呈现正态分布,对群体进行分子标记并构建遗传连锁图谱,进而对四个不同环境下的抗病QTLs进行定位,结果分别检测到与抗病相关的加性QTLs位点16、12、4和4个,分布于水稻10条染色体上,其中有多个位点被检测到同时控制几个性状,分别检测到上位性互作QTLs位点15、25、23和22对；其中在E4单环境、E2和E4联合定位以及四个环境的联合定位中均检测到位于第11染色体RM5704-RM202区间的抗病QTLs,这一结果与F2群体定位结果接近。3.2007年在海南对F2群体进行抗病性鉴定,亲本HH1B及RSB03的DG分别为5.4和4.3,群体表型呈现正态分布。对群体进行分子标记及QTLs定位分析,共检测到12个主效QTLs位点。在第11和12染色体上分别检测到一个控制DG的加性QTL位点,分别可以解释表型变异的18.07%和12.27%,其中位于第11染色体RM5349-RM202区间的位点还同时控制RLL及RLH两个性状,来自父本RSB03的等位基因起增强抗病性的作用；4.对材料RSB03人工接种纹枯病菌,对接种后第36h叶鞘及空白叶鞘取样提取RNA进行全基因组表达谱芯片,结果发现共有383个基因受纹枯病菌诱导表达且表达量变化倍率超过2倍；对已知功能的基因进行功能分类,发现共涉及生理进程,新陈代谢,细胞组分以及生物调节等21类,其中植物生理进程相关基因最多,达27个；5.结合F2群体QTLs定位及芯片表达谱实验结果,发现在第11染色体RM5389-RM202标记区间有9个差异表达基因(变化倍率≥2.0倍),对这批基因的表达量进行定量PCR分析,发现有5个基因受病菌诱导表达趋势与芯片结果吻合,其中2个基因受病菌诱导上调表达,3个基因下降表达；6.以RSB03材料的cDNA为模板克隆了定位于第11染色体RM5389-RM202区间的2个抗病候选基因Cg3和Cg8,这两个基因的表达量在接种病菌后分别表现为上调和下降,分别对这两个基因构建了超表达载体并转化水稻品种日本晴(Nipponbare),获得了单拷贝后代植株；7.基因Cg3开放阅读框(ORF)长度为930bp,与日本晴序列相比仅有2处碱基差异,但并未导致氨基酸水平上的不同,其编码的蛋白包含3个线粒体转运蛋白结构域,为一种跨膜类蛋白；转基因后代材料中Cg3基因的表达量显著上升,T1代株系与对照(Nipponbare)相比表现了良好的抗病性,其DG平均值为5.1～5.5,LL平均为14.0～21.3cm,而对照材料DG和LL分别为6.5和29.9cm,转基因株系与对照之间的差异达到极显著水平(P<0.01)；2010年在上海对转基因T2代材料人工接种,其发病较轻微,平均病级为4.0,低于对照材料的病级4.3,然而转基因材料与对照之间的差异不显著,鉴于当年异常的气候条件,真实病情有待进一步确定；8.基因Cg8的完整ORF全长为825bp,其编码的蛋白与日本晴相比有32个氨基酸(AA)的差异,其蛋白具有前端信号肽、跨膜区及亮氨酸重复等结构域,同样归为一类跨膜类蛋白；定量PCR结果表明转基因后代材料中该基因的表达量显著升高,对T1代进行接种鉴定发现除了转基因材料的株高显著高于对照外,其他几个抗病相关的性状上两者并没有显著差异,对T2进一步鉴定,同样发现转基因后代与对照并无显著差异,转基因后代的抗病性并没有提高。
