高糖对人视网膜色素上皮细胞氧化应激和炎症的影响及α-硫辛酸的干预作用

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)，作为一种复杂的代谢紊乱，已成为继癌症和心血管疾病之后的第三大死亡原因。据世界卫生组织估计，到2025年，全球糖尿病患病人数将达到3亿[1]。《中国2型糖尿病防治指南》2010年讨论版调查显示：我国目前糖尿病总体发病率已达9.7%，有超过9240万的糖尿病患者；另外还有约15.5%的人处于糖尿病前期，人数达1亿4千8百万以上，高于欧美发达国家。糖尿病慢性并发症现已成为造成糖尿患者致残或过早死亡的主要原因，而糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy, DR)作为最常见糖尿病慢性微血管并发症之一，每年因其造成的失明人数超过10,000人[2]。视网膜组织中含有丰富的多不饱和脂肪酸，这使得相对于其他组织，其对血液中氧分子的摄取量最高，由此而产生的氧化应激反应也最强。因此，视网膜对氧化应激较其他组织更为敏感。故有学者指出，高血糖、促氧化与抗氧化系统的平衡和氧化应激之间的关系是DR发病机制中的关键所在。核因子-κB(NF-κB)作为一种多效性的转录调节因子，在细胞生存、免疫、炎症等方面发挥重要调节作用。此外，NF-κB不仅是氧化还原反应的敏感因素，而且是抗氧化酶的重要调节器。根据细胞类型和疾病状态的不同，NF-κB的激活可以是抗凋亡或致凋亡，糖尿病诱导激活的NF-κB在视网膜以及其毛细血管细胞被认为是致凋亡的[3]。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)是一种能够介导细胞间黏附的膜表面糖蛋白，它在免疫应答、炎症反应和细胞凋亡等方面发挥重要作用。随着对氧化应激和炎症反应在DR发病机制中的探索，寻找更为合理有效的抗炎抗氧化药物，对提高患者的生活质量、减轻经济负担有重要意义，将成为DR药物研究的新方向。目的：本实验通过体外培养，研究高糖对人视网膜色素上皮(HRPE)细胞形态、细胞活力影响以及氧化应激水平和NF-κB、ICAM-1表达的变化，并应用高糖和不同浓度的α-硫辛酸(α-LA)共同作用于HRPE细胞，再观察上述指标的变化，探讨α-LA对高糖环境下HRPE细胞形态、细胞活力以及氧化应激水平和NF-κB、ICAM-1的表达的影响，以研究α-LA对高糖培养的HRPE细胞的保护作用并进一步探索该药治疗DR的可能机制。方法：体外培养HRPE细胞株，取生长状态良好的对数期细胞用于实验。将细胞分为8组：⑴正常对照组（葡萄糖浓度：5.56mmol/L）；⑵高糖组（葡萄糖浓度：30.00mmol/L）；⑶高渗对照组（渗透压：30.00mmol/L）；⑷高糖+α-硫辛酸（10μmol/L）组；⑸高糖+α-硫辛酸（50μmol/L）组；⑹高糖+α-硫辛酸（100μmol/L）组；⑺高糖+α-硫辛酸（200μmol/L）组；⑻高糖+α-硫辛酸（300μmol/L）组。各组细胞在不同的条件培养液中培养48h，留取样本进行检测。应用MTT法测细胞活力，比色法测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)变化并用Western Blot法测NF-κB的表达，ELISA法测ICAM-1含量的变化。结果：1相比正常对照组，高糖组HRPE细胞活性明显受抑制（P＜0.05），MDA、ICAM-1含量明显增加（P＜0.05），SOD、GSH含量明显减低（P＜0.05），NF-κB呈高表达（P＜0.05）；高渗对照组与正常对照组无显著差异（P＞0.05）。2给与α-LA干预后，相比高糖组，各给药组NF-κB表达均有所减低（P＜0.05）；除10μmol L浓度组外，其余四个浓度组细胞活性均有所恢复，差别有统计学意义（P＜0.05），MDA、ICAM-1含量减低（P＜0.05），SOD、GSH活性有所增加（P＜0.05）。3不同α-LA干预组进行两两比较发现，除100μmol L、200μmol L浓度组外，其余任意两组的MDA的含量有差别（P＜0.05）；300μmol L浓度组较50μmol L、100μmol L、200μmol L浓度组的SOD活性均有差异（P＜0.05）；各组GSH无明显差异（P＞0.05）；10μmol L浓度组较100μmol L、200μmol L、300μmol L浓度组，300μmol L浓度组较50μmol L、100μmol L浓度组的NF-κB表达有差别（P＜0.05）；300μmol L浓度组较50μmol L、100μmol L、200μmol L浓度组，200μmol L浓度组较50μmol L、100μmol L浓度组的ICAM-1含量有差别（P＜0.05），总体上药效呈剂量依赖性。结论：1高糖环境可导致HRPE细胞活性减低，MDA生成增加、SOD活性与GSH含量下降，NF-κB、ICAM-1表达量显著增加，提示高糖可通过氧化应激、NF-κB，ICAM-1对HRPE细胞造成损伤，氧化应激、NF-κB与ICAM-1的变化可能与DR的发生有关。2一定浓度的α-LA能降低高糖对HRPE细胞活性的影响，减少MDA生成，增加SOD活性与GSH含量，下调NF-κB、ICAM-1表达，从而改善HRPE细胞功能，减轻细胞损伤。提示α-LA可能通过这一途径而保护了HRPE细胞，因此推测其对DR有防治作用。3本实验研究表明，除NF-κB外，α-LA浓度达到50μmol/L以上时，其对HRPE细胞才能发挥保护作用，并且随药物作用浓度升高其对细胞保护作用越强，提示α-LA的应用须达到一定浓度才有效，且其对HRPE细胞的保护作用在一定范围内具有浓度依赖性。