SUR-8在哺乳动物胚胎心脏发育中的功能研究及其在其他系统中的功能初探

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据统计,有1%左右的新生儿患有先天性心血管畸形,其中有20%-30%是由于心脏瓣膜发育缺陷所致。心脏瓣膜发育是一个受多条信号通路精确调控的复杂过程,其中Ras信号通路扮演着相当重要的角色。SUR-8首次在线虫中作为Ras信号通路的正向作用因子被两个实验室同时独立发现。生化实验的结果证明,SUR-8可以通过结合Ras和Raf而加强他们之间的相互作用,并且提高下游作用因子ERK的活性。然而,作为一个结构相当保守的蛋白,它在哺乳动物中的生理功能仍不为人知。为了研究这一蛋白在哺乳动物心血管发育中的功能,我们利用基因打靶技术和Cre-LoxP系统首次建立了在内皮细胞系中特异性剔除Sur-8的小鼠模型。这种突变小鼠死于胚胎发育晚期,并伴随出现多种心脏缺陷表型。细胞学水平的研究发现,内皮细胞中SUR-8的剔除导致突变小鼠心脏房室管的内皮-间质细胞转化减少,以及转化后间质细胞增殖能力受损,从而影响了房室管心内膜垫的正常形成。然而,SUR-8被剔除后,Ras信号通路下游作用因子ERK的活性无论是在突变小鼠内皮细胞中还是在房室管组织中都未检测到有明显变化。进一步的研究发现,在突变小鼠的内皮细胞中,对小鼠心脏发育有重要作用的锌指蛋白转录因子GATA4的转录水平下降了40%。这一结果说明SUR-8对小鼠心脏房室管发育的作用可能独立于Ras/ERK通路,而是通过调控GATA4转录因子表达水平造成SUR-8剔除小鼠胚胎多种表型。我们的研究成果首次揭示了SUR-8在哺乳动物心脏发育中的重要作用。
摘要第6-7页
Abstract第7页
第一章 引言第8-18页
    1.1 哺乳动物心脏发育第8-14页
        1.1.1 心脏的分隔与心脏瓣膜结构第9-11页
        1.1.2 心脏瓣膜发育概述第11页
        1.1.3 内皮间质细胞转化(EMT)的研究现状第11-13页
        1.1.4 EMT的体外研究方法第13-14页
    1.2 SUR-8与Ras/ERK信号通路第14-18页
        1.2.1 Ras/ERK信号通路与先天性心脏缺陷第14-15页
        1.2.2 SUR-8研究现状第15-18页
第二章 材料与方法第18-29页
    2.1 分子生物学实验第18-23页
        2.1.1 打靶载体的构建第18页
        2.1.2 Southern印迹第18-19页
        2.1.3 小鼠基因型的鉴定第19-20页
        2.1.4 小鼠胚胎内皮细胞分离第20页
        2.1.5 RNA的抽提,半定量PCR和实时定量PCR第20-21页
        2.1.6 Western杂交第21-23页
    2.2 细胞生物学实验第23-25页
        2.2.1 ES细胞的培养第23页
        2.2.2 ES细胞电穿孔转染第23页
        2.2.3 ES克隆的鉴定第23-24页
        2.2.4 ES细胞核型分析第24页
        2.2.5 ES细胞嵌合体小鼠的培育第24-25页
    2.3 组织学实验第25-28页
        2.3.1 组织切片的制备第25页
        2.3.2 苏木精伊红(H&E)染色第25-26页
        2.3.3 抗体免疫荧光染色第26页
        2.3.4 小鼠胚胎PECAM-1抗体整染第26页
        2.3.5 小鼠胚胎心内膜垫体积估算第26-27页
        2.3.6 小鼠胚胎心内膜垫体外内皮-间质细胞转化(EMT)能力检测第27-28页
    2.4 小鼠的饲养与管理第28页
        2.4.1 转基因小鼠品系来源第28页
        2.4.2 自发活动行为测试(Open-field assay)第28页
        2.4.3 伤口愈合期上皮细胞增殖能力测试(wound healing)第28页
    2.5 统计学分析第28-29页
第三章 SUR-8在哺乳动物心脏发育中的功能研究第29-52页
    3.1 内皮细胞系特异性剔除Sur-8基因第29-34页
        3.1.1 全身性剔除Sur-8基因导致小鼠早期胚胎死亡第29页
        3.1.2 内皮细胞系特异性剔除Sur-8基因打靶过程第29-30页
        3.1.3 Sur-8条件剔除小鼠突变品系的培育及鉴定第30-34页
    3.2 Sur-8内皮细胞剔除导致小鼠胚胎死亡及心脏发育异常第34-40页
        3.2.1 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠死于胚胎期13.5天以后第34页
        3.2.2 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠胎盘,外周血管网络及大血管构成均发育正常第34-35页
        3.2.3 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠出现多种心血管畸形及心脏瓣膜发育异常第35-40页
    3.3 Sur-8内皮细胞剔除导致小鼠心脏房室管(AVC)心内膜垫发育异常,流出道(OFT)心内膜垫未见显著异常第40-46页
        3.3.1 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠房室管心内膜垫体积减少,流出道心内膜垫体积变化不大第40页
        3.3.2 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠房室管心内膜垫内皮间质细胞转化(EMT)能力下降,而流出道心内膜垫EMT能力变化不大第40-41页
        3.3.3 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠房室管心内膜垫间质细胞增殖能力下降第41-46页
    3.4 Sur-8可能是通过独立于Ras/ERK通路的方式来调控小鼠心脏发育的第46-49页
        3.4.1 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠内皮细胞中Ras通路的活性未受到显著的影响第46页
        3.4.2 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠房室管心内膜垫的Ras/ERK通路活性未有显著变化第46-47页
        3.4.3 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠内皮细胞中GATA4转录活性显著下降,其他被检转录因子活性未有显著变化第47-49页
    3.5 小结与讨论第49-52页
        3.5.1 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠出现多种心血管畸形的原因探讨第49页
        3.5.2 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠房室管和流出道心内膜垫EMT表型差异原因探讨第49-50页
        3.5.3 Sur-8~(Δ/flox);Tie2-Cre小鼠AVC心内膜垫发育异常分子机制探讨第50-52页
第四章 SUR-8在哺乳动物其他系统发育中的功能初探第52-60页
    4.1 SUR-8在小鼠中枢神经系统中的功能初探第52-56页
        4.1.1 Ras信号通路与哺乳动物神经系统的发育第52页
        4.1.2 现有的研究结果第52-53页
        4.1.3 讨论第53-56页
    4.2 SUR-8在小鼠皮肤角质细胞中的功能初探第56-60页
        4.2.1 Ras信号通路与哺乳动物皮肤发育第56页
        4.2.2 现有的研究结果第56-57页
        4.2.3 讨论第57-60页
总结与展望第60-61页
参考文献第61-70页
发表文章第70-71页
致谢第71-73页
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