中国对虾氧位—甲基转移酶基因克隆、表达分析与功能研究--附:泥鳅CD59基因克隆、表达分析与重组表达研究
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病害一直是困扰水产养殖业的最大问题,研究水产养殖品种的抗病相关基因,利用其本身的抗病因子加强抗病力,发展新的免疫防治对策,取代或减少药物使用是水产养殖品种病害防治的根本。本论文从细菌刺激的中国对虾中克隆了一个氧位-甲基转移酶基因,从细菌刺激的泥鳅中克隆了一个CD59基因,并对这两个基因进行了表达模式和功能研究,结果如下: 一、首次克隆了中国对虾COMT基因 儿茶酚-氧位-甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase,简称COMT,E.C.2.1.1.6)是一种氧位-甲基转移酶。尽管氧位-甲基转移酶转甲基的化学机制都是一样的,但由于甲基受体分子的不同,氧位-甲基转移酶的种类也有所不同。动物有两种氧位-甲基转移酶被广为研究:一种是法呢酸-氧位-甲基转移酶(famesoic acid-O-methyltransferase,简称FAMeT):另一种就是COMT。通过对甲壳动物FAMeT的研究得知,FAMeT是催化法呢酸甲基化反应生成法呢酸甲酯的氧位-甲基转移酶,对甲壳动物的生长、卵巢发育和蜕皮具有调控作用。COMT可以催化S腺苷蛋氨酸的一个甲基转移到含儿茶酚结构的底物分子上,形成甲基化的产物,所以,COMT可以灭活儿茶酚胺类以及其它的儿茶酚型化合物,当然,也包括含有儿茶酚结构的有毒物质和临床药物。 自从1958年人的COMT被首次发现以来,COMT在脊椎动物和无脊椎动物中都有发现,然而,关于甲壳类COMT的研究还未见报道。 本文利用抑制性消减杂交技术(SSH)和SMART cDNA方法,克隆了中国对虾COMT基因,该基因全长cDNA序列已提交给GenBank,登录号为DQ091255。中国对虾COMT基因全长917bp,含有一个完整的开放阅读框,编码的成熟肽由221个氨基酸组成,其理论分子量是24572.06 Da,等电点是5.27,推测该成熟肽有10个磷酸化的氨基酸位点,不具信号肽,说明中国对虾COMT不分泌到循环的血液中,而是依赖特定氨基酸的磷酸化起调控作用。另外,推测中国对虾COMT中第18-221个氨基酸残基构成了一个保守区,该保守区属于甲基转移酶-3家族。 甲基转移酶-3家族成员很多,包括COMT、细菌氧位-甲基转移酶(简写为OMT)和咖啡酰辅酶A-氧位-甲基转移酶(简写为CCoAOMT)。通过氨基酸序列比对发现,本文克隆的中国对虾COMT基因与人和其它的哺乳动物的COMTs具有较高的的同源性,而与甲壳动物十足目的FAMeTs没有重要的序列相似性。系统发育分析也将本文克隆的中国对虾COMT基因与其它物种的COMTs归为同一类群,而与甲壳动物的FAMeTs分属不同类群,依此推论中国对虾氧位-甲基转移酶基因不属于FAMeTs,而
中文摘要 | 第7-10页 |
ABSTRACT | 第10-13页 |
符号说明 | 第15-16页 |
第一章 综述:氧位-甲基转移酶研究进展 | 第16-39页 |
1.氧位-甲基转移酶概述 | 第16-22页 |
1.1 氧位-甲基转移酶的性质 | 第16-17页 |
1.2 微生物氧位-甲基转移酶 | 第17-19页 |
1.3 植物氧位-甲基转移酶 | 第19-20页 |
1.4 动物氧位-甲基转移酶 | 第20-22页 |
2.儿茶酚-氧位-甲基转移酶研究进展 | 第22-29页 |
2.1 COMT的分子特征 | 第22-23页 |
2.2 COMT的酶活性特点 | 第23-29页 |
3.中国对虾COMT的研究意义 | 第29-30页 |
参考文献 | 第30-39页 |
第二章 中国对虾氧位-甲基转移酶基因克隆与表达分析 | 第39-71页 |
1.材料 | 第39-41页 |
1.1 实验动物、组织和血淋巴 | 第39-40页 |
1.2 菌株和载体 | 第40页 |
1.3 试剂 | 第40页 |
1.4 仪器 | 第40-41页 |
2.方法 | 第41-59页 |
2.1 中国对虾血细胞cDNA消减文库构建 | 第41-45页 |
2.2 中国对虾氧位-甲基转移酶基因3’端克隆 | 第45-48页 |
2.3 中国对虾氧位-甲基转移酶基因5’端克隆 | 第48-49页 |
2.4 中国对虾氧位-甲基转移酶基因序列分析与系统发育分析 | 第49-50页 |
2.5 中国对虾氧位-甲基转移酶基因Northern blot | 第50-55页 |
2.6 中国对虾氧位-甲基转移酶基因原位杂交(In situ hybridisation,ISH) | 第55-59页 |
3.实验结果 | 第59-67页 |
3.1 中国对虾氧位-甲基转移酶基因克隆 | 第59-61页 |
3.2 中国对虾氧位-甲基转移酶基因序列分析 | 第61-62页 |
3.3 中国对虾氧位-甲基转移酶基因序列比对与系统发育分析 | 第62-65页 |
3.4 中国对虾氧位-甲基转移酶基因Northern blot | 第65-66页 |
3.5 中国对虾氧位-甲基转移酶基因原位杂交 | 第66-67页 |
4 讨论 | 第67-69页 |
4.1 中国对虾OMT基因与甲壳动物OMT基因序列比较 | 第67页 |
4.2 中国对虾OMT | 第67-69页 |
参考文献 | 第69-71页 |
第三章 中国对虾儿茶酚-氧位-甲基转移酶原核表达与功能分析 | 第71-90页 |
1.材料 | 第71-72页 |
1.1 载体、菌株和引物 | 第71-72页 |
1.2 试剂与仪器 | 第72页 |
1.3 色谱系统 | 第72页 |
2.方法 | 第72-79页 |
2.1 表达质粒Comt/pET-30a(+)构建 | 第72-74页 |
2.2 重组蛋白表达 | 第74-76页 |
2.3 重组蛋白纯化 | 第76-78页 |
2.4 重组蛋白COMT活性检测 | 第78-79页 |
3.实验结果 | 第79-89页 |
3.1 表达质粒Comt/pET-30a(+)构建 | 第79-80页 |
3.2 重组蛋白表达和纯化 | 第80-82页 |
3.3 重组蛋白COMT活性检测 | 第82-89页 |
参考文献 | 第89-90页 |
附:第一章 综述:鱼类免疫研究进展 | 第90-107页 |
1.鱼类获得性免疫 | 第90-92页 |
2.鱼类先天性免疫 | 第92-96页 |
2.1 鱼类先天免疫的非自身识别 | 第92-93页 |
2.2 鱼类先天免疫的防御体系 | 第93-96页 |
3.鱼类的补体免疫系统 | 第96-101页 |
3.1 补体激活途径 | 第96-97页 |
3.2 补体调控蛋白 | 第97-101页 |
参考文献 | 第101-107页 |
附:第二章 泥鳅CD59基因克隆、表达分析与重组表达研究 | 第107-134页 |
1.材料与试剂 | 第107-108页 |
1.1 材料 | 第107页 |
1.2 试剂 | 第107-108页 |
2.实验方法 | 第108-116页 |
2.1 泥鳅CD59基因cDNA克隆 | 第108-110页 |
2.2 泥鳅CD59基因内含子扩增 | 第110-112页 |
2.3 泥鳅CD59基因Northern blot | 第112-113页 |
2.4 RT-PCR扩增 | 第113页 |
2.5 泥鳅CD59基因原位杂交 | 第113页 |
2.6 泥鳅CD59基因原核表达 | 第113-116页 |
3.结果 | 第116-132页 |
3.1 泥鳅CD59基因克隆 | 第116-119页 |
3.2 泥鳅CD59基因序列比对与系统发育分析 | 第119-122页 |
3.3 泥鳅CD59基因Northern blot | 第122-124页 |
3.4 RT-PCR | 第124页 |
3.5 泥鳅CD59基因原位杂交 | 第124-125页 |
3.6 泥鳅CD59基因原核表达 | 第125-132页 |
参考文献 | 第132-134页 |
总结 | 第134-135页 |
致谢 | 第135-136页 |
攻读博士学位期间已发表和整理中的学术论文 | 第136-137页 |
学位论文评阅及答辩情况表 | 第137页 |
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