中国对虾氧位—甲基转移酶基因克隆、表达分析与功能研究--附:泥鳅CD59基因克隆、表达分析与重组表达研究

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病害一直是困扰水产养殖业的最大问题,研究水产养殖品种的抗病相关基因,利用其本身的抗病因子加强抗病力,发展新的免疫防治对策,取代或减少药物使用是水产养殖品种病害防治的根本。本论文从细菌刺激的中国对虾中克隆了一个氧位-甲基转移酶基因,从细菌刺激的泥鳅中克隆了一个CD59基因,并对这两个基因进行了表达模式和功能研究,结果如下: 一、首次克隆了中国对虾COMT基因 儿茶酚-氧位-甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase,简称COMT,E.C.2.1.1.6)是一种氧位-甲基转移酶。尽管氧位-甲基转移酶转甲基的化学机制都是一样的,但由于甲基受体分子的不同,氧位-甲基转移酶的种类也有所不同。动物有两种氧位-甲基转移酶被广为研究:一种是法呢酸-氧位-甲基转移酶(famesoic acid-O-methyltransferase,简称FAMeT):另一种就是COMT。通过对甲壳动物FAMeT的研究得知,FAMeT是催化法呢酸甲基化反应生成法呢酸甲酯的氧位-甲基转移酶,对甲壳动物的生长、卵巢发育和蜕皮具有调控作用。COMT可以催化S腺苷蛋氨酸的一个甲基转移到含儿茶酚结构的底物分子上,形成甲基化的产物,所以,COMT可以灭活儿茶酚胺类以及其它的儿茶酚型化合物,当然,也包括含有儿茶酚结构的有毒物质和临床药物。 自从1958年人的COMT被首次发现以来,COMT在脊椎动物和无脊椎动物中都有发现,然而,关于甲壳类COMT的研究还未见报道。 本文利用抑制性消减杂交技术(SSH)和SMART cDNA方法,克隆了中国对虾COMT基因,该基因全长cDNA序列已提交给GenBank,登录号为DQ091255。中国对虾COMT基因全长917bp,含有一个完整的开放阅读框,编码的成熟肽由221个氨基酸组成,其理论分子量是24572.06 Da,等电点是5.27,推测该成熟肽有10个磷酸化的氨基酸位点,不具信号肽,说明中国对虾COMT不分泌到循环的血液中,而是依赖特定氨基酸的磷酸化起调控作用。另外,推测中国对虾COMT中第18-221个氨基酸残基构成了一个保守区,该保守区属于甲基转移酶-3家族。 甲基转移酶-3家族成员很多,包括COMT、细菌氧位-甲基转移酶(简写为OMT)和咖啡酰辅酶A-氧位-甲基转移酶(简写为CCoAOMT)。通过氨基酸序列比对发现,本文克隆的中国对虾COMT基因与人和其它的哺乳动物的COMTs具有较高的的同源性,而与甲壳动物十足目的FAMeTs没有重要的序列相似性。系统发育分析也将本文克隆的中国对虾COMT基因与其它物种的COMTs归为同一类群,而与甲壳动物的FAMeTs分属不同类群,依此推论中国对虾氧位-甲基转移酶基因不属于FAMeTs,而
中文摘要第7-10页
ABSTRACT第10-13页
符号说明第15-16页
第一章 综述:氧位-甲基转移酶研究进展第16-39页
    1.氧位-甲基转移酶概述第16-22页
        1.1 氧位-甲基转移酶的性质第16-17页
        1.2 微生物氧位-甲基转移酶第17-19页
        1.3 植物氧位-甲基转移酶第19-20页
        1.4 动物氧位-甲基转移酶第20-22页
    2.儿茶酚-氧位-甲基转移酶研究进展第22-29页
        2.1 COMT的分子特征第22-23页
        2.2 COMT的酶活性特点第23-29页
    3.中国对虾COMT的研究意义第29-30页
    参考文献第30-39页
第二章 中国对虾氧位-甲基转移酶基因克隆与表达分析第39-71页
    1.材料第39-41页
        1.1 实验动物、组织和血淋巴第39-40页
        1.2 菌株和载体第40页
        1.3 试剂第40页
        1.4 仪器第40-41页
    2.方法第41-59页
        2.1 中国对虾血细胞cDNA消减文库构建第41-45页
        2.2 中国对虾氧位-甲基转移酶基因3’端克隆第45-48页
        2.3 中国对虾氧位-甲基转移酶基因5’端克隆第48-49页
        2.4 中国对虾氧位-甲基转移酶基因序列分析与系统发育分析第49-50页
        2.5 中国对虾氧位-甲基转移酶基因Northern blot第50-55页
        2.6 中国对虾氧位-甲基转移酶基因原位杂交(In situ hybridisation,ISH)第55-59页
    3.实验结果第59-67页
        3.1 中国对虾氧位-甲基转移酶基因克隆第59-61页
        3.2 中国对虾氧位-甲基转移酶基因序列分析第61-62页
        3.3 中国对虾氧位-甲基转移酶基因序列比对与系统发育分析第62-65页
        3.4 中国对虾氧位-甲基转移酶基因Northern blot第65-66页
        3.5 中国对虾氧位-甲基转移酶基因原位杂交第66-67页
    4 讨论第67-69页
        4.1 中国对虾OMT基因与甲壳动物OMT基因序列比较第67页
        4.2 中国对虾OMT第67-69页
    参考文献第69-71页
第三章 中国对虾儿茶酚-氧位-甲基转移酶原核表达与功能分析第71-90页
    1.材料第71-72页
        1.1 载体、菌株和引物第71-72页
        1.2 试剂与仪器第72页
        1.3 色谱系统第72页
    2.方法第72-79页
        2.1 表达质粒Comt/pET-30a(+)构建第72-74页
        2.2 重组蛋白表达第74-76页
        2.3 重组蛋白纯化第76-78页
        2.4 重组蛋白COMT活性检测第78-79页
    3.实验结果第79-89页
        3.1 表达质粒Comt/pET-30a(+)构建第79-80页
        3.2 重组蛋白表达和纯化第80-82页
        3.3 重组蛋白COMT活性检测第82-89页
    参考文献第89-90页
附:第一章 综述:鱼类免疫研究进展第90-107页
    1.鱼类获得性免疫第90-92页
    2.鱼类先天性免疫第92-96页
        2.1 鱼类先天免疫的非自身识别第92-93页
        2.2 鱼类先天免疫的防御体系第93-96页
    3.鱼类的补体免疫系统第96-101页
        3.1 补体激活途径第96-97页
        3.2 补体调控蛋白第97-101页
    参考文献第101-107页
附:第二章 泥鳅CD59基因克隆、表达分析与重组表达研究第107-134页
    1.材料与试剂第107-108页
        1.1 材料第107页
        1.2 试剂第107-108页
    2.实验方法第108-116页
        2.1 泥鳅CD59基因cDNA克隆第108-110页
        2.2 泥鳅CD59基因内含子扩增第110-112页
        2.3 泥鳅CD59基因Northern blot第112-113页
        2.4 RT-PCR扩增第113页
        2.5 泥鳅CD59基因原位杂交第113页
        2.6 泥鳅CD59基因原核表达第113-116页
    3.结果第116-132页
        3.1 泥鳅CD59基因克隆第116-119页
        3.2 泥鳅CD59基因序列比对与系统发育分析第119-122页
        3.3 泥鳅CD59基因Northern blot第122-124页
        3.4 RT-PCR第124页
        3.5 泥鳅CD59基因原位杂交第124-125页
        3.6 泥鳅CD59基因原核表达第125-132页
    参考文献第132-134页
总结第134-135页
致谢第135-136页
攻读博士学位期间已发表和整理中的学术论文第136-137页
学位论文评阅及答辩情况表第137页
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